基于HPLC的牡丹叶指纹图谱分析与7种成分定量方法的建立

肖会敏，赵利娟，杨 旭，张 妍，林 奋，李 捷，王四旺#，高锦明

(1 西北农林科技大学化学与药学院药学系，杨凌 712100；2 陕西凤丹正元生物科技有限公司研发部；3 陕西中药研究所，陕西医药信息中心；4 西北大学生命科学与医学部中药系；5 空军军医大学中药与天然药物教研室；*通讯作者,E-mail:jinminggao@nwafu.edu.cn；#共同通讯作者，E-mail:wangsiw@fmmu.edu.cn)

牡丹叶为毛茛科植物牡丹(PaeoniaAndr.)的干燥叶，主要产于陕西、山东、安徽、河南等地，秋季采收[1]。牡丹叶中含有苷类、多酚类、黄酮类等成分，苷类如芍药苷、羟基芍药苷等，多酚类如没食子酸、没食子酸甲酯、鞣花酸等[2-6]。研究表明牡丹叶具有抗炎、降尿酸、抗肿瘤、抗氧化、缓解痛风性关节炎等作用[7-13]。牡丹叶中芍药苷对辐射损伤内皮细胞有保护作用、可改善认知功能障碍及抑郁焦虑等作用[14-19]，鞣花酸对阿尔茨海默病引起的学习和记忆障碍具有改善作用[20,21]，酚类如没食子酸、没食子酸甲酯、1，2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖等具有抗氧化、抗肿瘤、保肝、抗病毒等作用[22-25]，野漆树苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷具有抗肿瘤、抗高血压、抗氧化作用及抑制黄嘌呤氧化酶作用[26,27]。目前未发现有牡丹叶指纹图谱与多成分定量的研究。因此，笔者参照中药指纹图谱的有关技术要求[28,29]采用高效液相色谱(HPLC)法进行研究，为建立一种全面科学的方法评价牡丹叶药材的质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

UFLC高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-100DA型台式数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)型色谱柱(日本岛津公司)；MD200型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；KQ-5200DE型台式数控超声波清洗器(上海虔钧科学仪器有限公司)。乙腈与甲醇(HPLC级，美国Fisher公司)；水为自制超纯水；其余为分析纯。没食子酸(编号：HG230820)、芍药苷(编号：HP003024)、鞣花酸(编号：HE230830)、没食子酸甲酯(编号：HA063031)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(编号：HA060604)、野漆树苷(编号：HR179500，纯度98%)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(编号：HA204891)，纯度均为≥98%，均购自宝鸡晨光生物科技有限公司；牡丹叶：陕西合阳(批号：201002，201003，201004，201005)、陕西蒲城(批号：200924，200925，200926)、山东菏泽(批号：200927，200928)、陕西西安(批号：200929)，陕西凤丹生物科技有限公司提供。

1.2 指纹图谱测定方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.085%磷酸水溶液(B)，按表1梯度洗脱。记录时间为85 min。流速：0.8 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：234 nm；进样量10 μl。

表1 七种成分含量测定的梯度洗脱Table 1 Gradient elution for determination of seven components

1.2.2 各种溶液的制备

1.2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、野漆树苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷适量，加70%甲醇溶解即得混合对照品溶液，其浓度分别为882.00，980.00，1 176.00，2 156.00，735.00，686.00，588.00 μg/ml，作为储备液。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，称定质量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)45 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 ml，置10 ml量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 精密度试验 取供试品溶液(批号201002)，连续进样6次，以鞣花酸为参照峰，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析考察。计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD。

1.2.4 稳定性试验 取供试品溶液(批号201002)，分别于0，2，4，8，12，24 h进样，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积。计算各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD。

1.2.5 重复性试验 取6份供试品(批号201002)，按供试品溶液的制备与色谱条件进行分析，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析考察。计算各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD。

1.2.6 指纹图谱建立及相似度分析 取10批牡丹叶样品，分别按供试品溶液的制备与色谱条件进行分析，进样量10 μl，记录指纹图谱，鞣花酸为参照物，建立指纹图谱。计算10批样品共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD。运用文献[29]方法对10批牡丹叶的指纹图谱进行相似度分析，将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，对选定20个共有色谱峰进行谱峰匹配，通过计算得出样品对照指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为标准(对照图谱)，进行整体相似度评价。

1.2.7 特征峰的指认 取供试品、混合对照品、空白溶剂进样测定记录色谱峰，依据结果进行比对指认。

1.3 成分的含量测定方法

1.3.1 色谱条件 见“1.2.1”项。

1.3.2 对照品溶液的制备 见1.2.2项。

1.3.3 供试品溶液的制备 见1.2.2项。

1.3.4 标准曲线及线性范围 分别精密量取1.2.2项下储备液0.01，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 ml，分别置于1 ml量瓶中，加70%甲醇定容至1 ml，分别得系列混合对照品溶液。进样测定，记录峰面积，考察对照品浓度(x)与峰面积(y)的线性关系。

1.3.5 精密度试验 取供试品溶液(样品批号200929)，连续测定6次，进样测定峰面积，计算没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、野漆树苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的RSD。

1.3.6 稳定性试验 取供试品溶液(样品批号200929)，分别于0，2，4，8，12，24 h，进样测定峰面积，计算没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、野漆树苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的RSD。

1.3.7 重复性试验 称取样品(样品批号200929)1 g，精密称定，按上1.3.2项供试品制备方法制备6份供试品溶液及按1.3.1项测定方法测定。计算没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、野漆树苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量与RSD。

1.3.8 加样回收率试验 称取样品(批号200929)0.5 g，精密称定，分别添加对照品溶液10 ml(取没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、野漆树苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷适量，加70%甲醇，摇匀使溶解，即混合对照品其浓度分别为没食子酸0.083 mg/ml、没食子酸甲酯0.105 mg/ml、芍药苷0.390 mg/ml、鞣花酸2.540 mg/ml、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖0.304 mg/ml、野漆树苷0.081 mg/ml、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.071 mg/ml的混合对照溶液)，再依据1.3.2项制备溶液与1.3.1项测定方法测定。

1.3.9 样品含量测定 测定10批药材中7个成分的含量，按照1.3.2项供试品制备方法制备样品溶液，按照1.3.1项检测方法测定。

2 结果

2.1 指纹图谱测定

2.1.1 精密度试验 精密度结果显示各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于1.0%和5.0%(见表2)，表明该方法精密度良好。

表2 指纹图谱精密度试验相对保留时间与相对峰面积测定结果Table 2 Relative retention time and relative peak area in fingerprint precision test

2.1.2 稳定性试验 稳定性结果显示各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于1.0%和5.0%(见表3)，表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

表3 指纹图谱稳定性试验相对保留时间与相对峰面积测定结果Table 3 Relative retention time and relative peak area in fingerprint stability test

2.1.3 重复性试验 重复性结果显示各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于1.0%和5.0%(见表4)，表明该方法重复性良好。

表4 指纹图谱重复性试验相对保留时间与相对峰面积测定结果Table 4 Relative retention time and relative peak area in fingerprint repeatability experiment

2.1.4 指纹图谱建立及相似度分析 相似度分析结果显示，对选定20个共有色谱峰进行谱峰匹配，得共有模式，并以此共有模式为标准(对照图谱)，进行整体相似度评价，结果相似度大于0.900(见图1、图2、表5)；10批样品共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值结果显示均分别小于1.0%和5.0%(见表6，7)。表明这10批牡丹叶的化学成分一致性较好。

1～20为特征指纹峰；1.没食子酸；5.没食子酸甲酯；11.芍药苷；13.鞣花酸(作为参照物的色谱峰)；16.1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖；18.野漆树苷；19.芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷图1 牡丹叶HPLC对照指纹图谱Figure 1 HPLC fingerprint of Moutan Folium

R.指纹图谱(对照图谱)；S1～S10.批号分别为201002，201003，201004，201005，200924，200925，200926，200927，200928，200929图2 10批牡丹叶的HPLC指纹图谱Figure 2 HPLC fingerprint of 10 batches of Moutan Foliums

表5 10批药材相似度结果Table 5 Similarity results of 10 batches of medicinal materials

表6 10批样品相对保留时间结果Table 6 Relative retention time of 10 batches of samples

2.1.5 特征峰的指认 通过对照品与指纹图谱色谱图比对，结果显示特征峰1为没食子酸、特征峰5为没食子酸甲酯、特征峰11为芍药苷、特征峰13为鞣花酸、特征峰16为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、特征峰18为野漆树苷、峰7(特征峰19)为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(见图3)。

1.没食子酸；2.没食子酸甲酯；3.芍药苷；4.鞣花酸；5.1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖；6.野漆树苷；7.芹菜素7-O-葡萄糖苷图3 供试品、混合对照品及阴性对照HPLC色谱图Figure 3 HPLC chromatogram of sample, mixed control and negative control

2.2 成分的含量测定

2.2.1 标准曲线及线性范围 对照品浓度(x)与峰面积(y)的线性关系，结果见表8，说明在相应浓度范围内，线性关系良好。

表8 七种成分的线性方程与范围及相关系数Table 8 Linear equation, range and correlation coefficient of seven components

2.2.2 精密度试验 没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、野漆树苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.37%，1.08%，1.45%，1.23%，1.01%，0.99%，1.91%，说明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、野漆树苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.18%，1.16%，1.45%，1.28%，1.34%，1.83%，1.97%，说明检测样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.4 重复性试验 没食子酸、没食子酸甲酯、芍药苷、鞣花酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、野漆树苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量分别为1.645 42 mg/g，2.097 67 mg/g，7.804 70 mg/g，50.580 93 mg/g，6.058 55 mg/g，1.624 63 mg/g，1.419 60 mg/g，其RSD均小于2%(见表9)，说明仪器重复性良好。

表9 重复性试验结果 (n=6)Table 9 Results of repeatability test (n=6)

2.2.5 加样回收率试验 结果显示各成分平均回收率均大于96%，RSD均小于2.0%(见表10)，说明本方法回收率良好。

表10 加样回收率试验结果 (n=6)Table 10 Results of sample recovery test (n=6)

2.2.6 样品含量测定 10批牡丹叶样品中没食子酸甲酯、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、野漆树苷含量的RSD均大于5%(见表11)，说明不同批次不同产地有些成分含量有差异。

表11 10批药材中7种成分的含量 (mg/g)Table 11 Content of 7 components in 10 batches of medicinal materials (mg/g)

3 讨论

3.1 色谱条件

采用全波长对牡丹叶样品进行测定，依据对应波长下峰的信息量，结果显示234 nm时信息量较多，故将其作为HPLC方法的定性定量波长。由于牡丹叶中成分众多，各成分溶解性不一样，等度洗脱难以充分洗脱，所以采用梯度洗脱的方法。采用梯度洗脱，曾选择不同品牌的反相C18色谱柱如Shim-pack Scepter C18、Ultimate XB C18、Intersil C18、Kromasil C18进行过比较，选择不同规格如250 mm×4.6 mm(5 μm)、150 mm×4.6 mm(5 μm)等进行过比较，选择不同流动相系统如甲醇-水、乙腈-磷酸水溶液(0.043%，0.085%，0.17%)、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液(0.1%，0.2%，0.5%，1.0%)等，比较不同柱温(20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃)、不同流速(0.5，0.8，1.0，1.2 ml/min)；最终结果采用Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)与流动相系统乙腈-0.085%磷酸水溶液、柱温为30 ℃、流速为0.8 ml/min，结果分离度较好，故将此条件作为检测色谱条件。

3.2 供试品制备方法

本品选择溶剂(水、不同浓度的甲醇、不同浓度乙醇)；考察提取方法：超声提取(15，20，25，30，35，40，45，50，55，60 min)、加热回流提取(10，20，30，40，50，60 min)等。由于加热回流提取物与超声提取物比较未见更多色谱峰信息，而超声提取时间短色谱峰信息丰富。综合上述各因素选择70%甲醇超声处理45 min，得到较理想的色谱峰信息(如峰面积大、分离度好等)。

3.3 参照峰的选择

通过对照品与供试样品色谱图比对，发现特征峰13为鞣花酸，该峰在特征指纹峰中峰面积较大，且分离度良好，因此选择此峰作为参照峰。

综上所述，经上述研究建立了牡丹叶的HPLC指纹图谱分析方法与7成分含量的测定方法，经过方法学验证定性定量方法，该方法操作简单、准确、稳定、重复性好，易于实施，因此该方法可作为牡丹叶质量的有效评价方法，为完善牡丹叶药材的标准提供了依据。