固态发酵对金针菇菌渣品质改良及发酵品贮藏条件的探究

杨家军，陈 明，宋春雷，王辰汝，杜振宇，刘国芳

(江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400)

我国食用菌栽培发展迅猛，目前已成为世界食用菌生产第一大国。工厂化栽培中，食用菌经采收后，其培养料即成菌渣。每生产1 kg食用菌，会产生0.6 kg菌渣[1]。菌渣是秸秆、木屑等原料培养出食用菌的剩余物，也称菌糠。菌渣中含有丰富的营养成分：如微量元素、矿物质、菌体蛋白质、多种代谢产物及未被充分利用的有机质，是较好的堆肥原料[2]。但其通常也含有害物质，如：青霉菌、白曲霉菌、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、大肠杆菌、沙门氏菌、寄生虫虫卵、钙、汞、铅、铜、镉等。如直接用于饲喂动物，会阻碍动物生长，降低生产性能[3-4]。因此，菌渣需适当处理后，才能更好地饲喂动物[5]。

益生菌为动物体内固有的微生物，主要包括芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、放线菌等，具有提高机体免疫力、抗氧化水平、优化肠道菌群结构、促进动物生长和生产性能等功效[6]。益生菌可被用于常规饲料的发酵，也可被用于青贮饲料如玉米秸秆、黑麦草、苜蓿、三叶草、紫云英等的发酵。物料发酵后，不仅改善了口感，还提高了可吸收蛋白质、糖、氨基酸的含量，易被机体吸收。在物料发酵时，添加适当的益生菌菌株，还可起到脱毒、分解转化的作用[7]。

发酵制品生产后，如果贮藏方式选择不当，活菌数量会显著降低，且易发生霉变。畜禽采食后，造成采食量下降，生长速度减慢，饲料报酬率降低，甚至中毒，给养殖业带来巨大的危害[3]。

本试验选择枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌作为发酵菌种，添加到金针菇菌渣中进行固态发酵，检测经固态发酵后样品中消化酶活性、益生菌活菌数量、霉菌数量、磷元素含量、水分、黄曲霉毒素B1含量；评价金针菇菌渣固态发酵品质；同时探究4种不同贮藏条件对发酵产品活菌数量和霉变的影响，筛选出最佳贮藏方式，为金针菇菌渣的资源化和饲料化利用提供参考依据。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1试验菌种与菌渣

枯草芽孢杆菌和唾液乳杆菌菌种由江苏农林职业技术学院益生菌教研组提供，专利保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC17718和14246；金针菇菌渣由南京金万辰生物科技有限公司提供。

1.1.2培养基制备

普通营养琼脂、孟加拉红琼脂培养基、乳酸菌计数培养基(MRS)，分别用于测定枯草芽孢杆菌数、霉菌数以及乳酸菌数。培养基按配方制备后，高压灭菌，制备成平板，冷却凝固后，倒置放入4 ℃冰箱，备用。

1.2 方法

1.2.1固态发酵

使用枯草芽孢杆菌和唾液乳杆菌混合菌种，进行金针菇菌渣固态发酵。菌渣与菌种的接种比例为10∶6，发酵温度34 ℃，需氧发酵20 h。发酵完成后，称量发酵产品2 g，加入18 ml无菌生理盐水，充分混匀，备测。

1.2.2贮藏方式

称取100 g经固态发酵的金针菇菌渣，装入自封袋。根据饲料贮藏的3种因素：光照、温度、密闭，设计4种贮藏方式：①室温、不透气、避光，②室温、不透气、不避光，③室温、透气、避光，④低温、不透气、避光。分用有孔灰色编织袋包装设置为透气包装，无孔不透气自封袋包装设置为不透气包装。每个处理制作6个平行样。样品称量后，按照4种方式进行贮藏。未发酵的金针菇菌渣采用室温、透气、不避光保存，作为对照。在样品贮藏7、15和30 d，分别取2 g样品，加入18 ml无菌生理盐水，充分混匀。备测。

1.2.3检测方法

1.2.3.1水分和消化酶检测

使用水分测定仪测定水分。蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按照说明书，进行各消化酶测定。

1.2.3.2益生菌活菌数和霉菌计数

将样品充分混匀后，分别取1 ml混悬液，加入9 ml生理盐水，进行倍比稀释，至106倍稀释后取100 μl，分别涂布在普通营养琼脂、MRS琼脂、孟加拉红琼脂培养基上，用于计数枯草芽孢杆菌、唾液乳杆菌活菌数量和霉菌数量。

1.2.3.3固态发酵后益生菌形态鉴定

分别取纯培养的枯草芽孢杆菌、唾液乳杆菌和固态发酵计数时培养的枯草芽孢杆菌、唾液乳杆菌，先肉眼观察菌种活化与计数培养所得细菌的菌落，2种情况是否存在差异；后用接种针，挑取菌落，采用革兰氏染色，等待干燥、固定后，镜检，观察形态差异[8]。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，染色镜检呈紫色，杆状；乳酸菌是革兰氏阳性菌，染色镜检呈紫色，短杆稍细。

1.2.3.4钙、磷和黄曲霉毒素B1测定

钙测定采用钙测试盒微板法，磷测定采用磷测试盒比色法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所；黄曲霉毒素B1采用ELISA法检测[9]，试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，按照说明书，进行测定。

1.3 数据统计与分析

所有数据均以“平均数±标准差”表示，用SPSS17.0软件进行统计分析，Duncan氏法进行多重比较，以“P<0.05”作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 固态发酵对金针菇菌渣营养品质的影响

菌渣经固态发酵后，营养成分发生了显著变化(见表1)。水分显著下降，由发酵前52.02%降至46.11%(P<0.05)。发酵后，枯草芽孢杆菌和唾液乳杆菌活菌数量分别达到2.1×109CFU/g和1.8×109CFU/g(P<0.01)；蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶活力水平显著升高(P<0.01)，分别达到165.19、10.68、472.09、215.09 U/g。霉菌显著下降(P<0.05)，由发酵前1.8×108CFU/g降低至9.8×106CFU/g(P<0.05)。黄曲霉毒素B1含量下降至0.043 pg/g(P<0.01)。钙含量显著下降，由19.93 mol/g降低至12.27 mol/g(P<0.05)；磷含量有下降趋势，但差异不显著(P>0.05)。

表1 营养成分变化

2.2 固态发酵后益生菌形态鉴定

比较2种途径下枯草芽孢杆菌的菌落形态，发现菌落形态一致，为干燥、褶皱、中型菌落。打开平皿盖，有特殊的蜡烛气味。经革兰氏染色，均为蓝紫色短杆状，中间含有浓染芽孢体，如图1所示。

图1 枯草芽孢杆菌菌落形态与革兰氏染色镜检结果(100×)

同时比较了唾液乳杆菌纯培养与固态发酵计数时唾液乳杆菌的形态，结果表明，菌落形态一致，为针尖状、湿润、小型菌落。革兰氏染色呈蓝紫色，球状和短杆状，如图2所示。

图2 唾液乳杆菌菌落形态与革兰氏染色镜检结果(100×)

2.3 不同贮藏条件对发酵产品品质的影响

采用4种不同的方式进行贮藏。发酵产品在采取方式①贮藏3 d后，与其他组相比，水分显著下降(P<0.05)，唾液乳杆菌和枯草杆菌数量无显著变化(P>0.05)。方式③水分极显著下降(P<0.01)，唾液乳杆菌和枯草杆菌数量无显著变化(P>0.05)，霉菌数量显著下降(P<0.05)。方式④唾液乳杆菌和霉菌数量都显著下降(P<0.05)，见表2。黄曲霉毒素B1含量，方式②最高(P<0.01)，其他3个方式之间没有显著差异(P>0.05)。

表2 贮藏3 d后4种贮藏方式下的微生物变化情况

发酵产品贮藏7 d后，结果见表3。与其他贮藏相比，方式①水分仍保持下降(P<0.05)，室温保存的3个方式唾液乳杆菌和枯草杆菌数量无显著变化(P>0.05)，与贮藏3 d相比，呈下降趋势。方式③水分极显著下降(P<0.01)，唾液乳杆菌和枯草杆菌数量皆无显著变化(P>0.05)，而霉菌数量与其他组相比，显著下降(P<0.05)。方式④乳杆菌和霉菌数量，皆为显著降低(P<0.05)。黄曲霉毒素B1含量：方式②组最高(P<0.01)，方式①高于方式③和④组(P<0.01)，方式③最低(P<0.01)。

表3 贮藏7 d时4种贮藏方式下的微生物变化情况

发酵产品经贮藏15 d后，结果如表4所示。方式①水分与7 d相比下降了2个百分点；唾液乳杆菌和枯草杆菌数量无显著变化(P<0.05)。方式③水分极显著低于其他组(P<0.01)，乳杆菌和枯草芽孢杆菌数量没有发生显著变化(P>0.05)，霉菌数量显著低于其他组(P<0.05)。常温保存的3个组，益生菌活菌数量与7 d相比，呈一定上升。方式④唾液乳杆菌、枯草芽孢杆菌和霉菌数量显著低于其他组(P<0.05)。方式②黄曲霉毒素B1含量最高(P<0.01)。

表4 贮藏15 d后4种贮藏方式下的微生物变化情况

发酵样品贮藏30 d后，结果如表5所示。方式①水分显著低于方式②组；与贮藏15 d相比，无变化。唾液乳杆菌数量显著高于方式②(P<0.05)。方式③水分最低(P<0.01)，枯草芽孢杆菌数量显著高于其他组(P<0.05)，霉菌数量显著低于方式①和②(P<0.05)。方式④唾液乳杆菌、枯草芽孢杆菌和霉菌数量与方式①和②相比，显著下降(P<0.05)。方式①、③和④黄曲霉毒素B1含量极显著低于方式②(P<0.01)。

表5 30天时四种贮藏方式下的三种菌的数据

3 讨论

新鲜金针菇菌渣含水量高，容易霉变。故常使用固态发酵的方法进行处理，从而减少水分，便于烘干。在选择发酵菌种时，使用具有产消化酶的益生菌。益生菌利用金针菇菌渣中的营养物质，发酵时产生消化酶，降解金针菇菌渣中的营养物质，供自身生长繁殖需要；同时益生菌被动物采食后，进入消化道，其生长繁殖时，所产生的消化酶可帮助机体对营养物质的消化，促进吸收。此外选择抗逆性强的菌株，菌体能够在不利生存的环境下，仍能生存，提高了活菌数量，可增强发酵效果。

本研究选择了2株获得国家专利保藏的菌株：枯草芽孢杆菌和唾液乳杆菌，具有产消化酶和抗逆性强的特征[10-11]。在固态发酵完成后，产品中水分与发酵前相比显著下降，说明固态发酵时，产生热量，使水分部分散发，便于贮藏[12]。由于益生菌繁殖生长，发酵后产品中的蛋白酶、脂肪酶活力、α-淀粉酶、β-淀粉酶活力水平升高。对发酵产品中这2株益生菌与原菌种进行比较，经过菌落形态和细菌形态观察，证明发酵产品中为原添加的2株益生菌生长繁殖而形成。发酵产品中钙含量显著下降，而磷元素含量没有显著变化。

本着便于实际生产为目的，设计了4种不同的贮藏方式。结果表明，在贮藏7 d内，益生菌可以利用金针菇中残留的营养物质，继续缓慢生长。贮藏时间为3～7 d，各贮藏处理组中，益生菌活菌数量呈现一定程度的下降。细菌的适宜生长温度为37℃，而室温为20～25℃。室温下不利于细菌生长繁殖，菌体繁殖和死亡达不到平衡，此时益生菌繁殖生长数量低于死亡数量，因此结果显示两种益生菌活菌数量下降。在7 d后，细菌通过降低自身代谢，适应了贮藏环境，繁殖数量超过死亡数量，活菌数量上升。尤其是抗逆性强的芽孢杆菌[13]。

霉菌生长时受到水分的影响，在一定范围内，水分越大，霉菌生长越快；同时霉菌生长受到益生菌生长的抑制。在发酵起始过程，2种益生菌的接种数量大，快速的利用菌渣中的营养成分，不断生长繁殖。益生菌产生的活性物质，可有效分解菌渣原有的霉菌毒素，降低发酵菌渣中毒素含量，与先前报道一致[14]。另外，从微生态角度分析，在发酵过程中，大量的益生菌迅速建立优势菌群，明显抑制霉菌的生长繁殖，有效减少了霉菌毒素的产生。这两方面，皆有利于发酵产品后期的贮藏[15]。

方式①水分散失慢，易滋生霉菌，方式②霉菌一直维持较高数量，黄曲霉毒素B1含量高于其他3个组。方式③益生菌不断缓慢生长，在贮藏15 d后，随着发酵产品贮藏时间的延长，益生菌生长繁殖与死亡数量基本维持平衡，数量稳定。益生菌长期处于优势菌，抑制霉菌生长，使得霉菌数量持续下降，菌渣中的霉菌毒素进一步分解，含量进一步下降。结果表明：黄曲霉毒素B1随着贮藏时间延长，浓度出现下降，且低于饲料卫生标准[16]。益生菌发酵不断产热，加上透气，逐渐减少发酵产品中的水分，使得水分下降至7.69%，远低于国家饲料标准规定的范围。方式④是发酵食品常用的贮藏方式，该方式由于温度低，可有效降低发酵品中的霉菌数量和黄曲霉毒素B1含量；但4℃同样不利于益生菌的生长繁殖，益生菌生长繁殖数量低于死亡数量，导致益生菌活菌数量明显下降，以唾液乳杆菌最为显著，因此方式④不建议采用。

4 小结

本研究使用枯草芽孢杆菌和唾液乳杆菌对金针菇菌渣进行固态发酵，改善了金针菇菌渣的营养品质，提高了益生菌活菌数量，降低了霉菌数量和黄曲霉毒素B1含量，有效提高了消化酶活力，降低了金属钙的含量。采用室温、透气、避光对发酵产品进行贮藏，可以有效维持益生菌活菌数量，30 d内仍达到109CFU/g，超过国家发酵饲料标准。水分降至7.69%，可抑制霉菌生长。霉菌含量和黄曲霉毒素含量均符合国家饲料卫生标准要求。