基于正交试验法双酸酸蚀参数对SMAT 纯Ti 性能的影响

谢晓明，何美凤

（上海理工大学 材料与化学学院，上海 200093）

纯Ti 作为生物医用金属材料，具有优异的生物相容性与良好的机械加工性能，已被广泛应用于牙科、骨科与整形植入物领域，且在心脏支架与外置型电子装置，例如刺激骨生长的电子装置方面有着较多的应用。然而纯Ti 的弹性模量高于人体骨骼的，易引起应力屏蔽，导致骨密度降低、骨组织吸收及引起进一步的并发症。Ti 在自然界中极易氧化，表面生成的氧化层以TiO为主，其结构松散，耐蚀性不够理想，且与植入组织的细胞反应活性低。有学者认为，表面氧化层的存在，使得纯Ti 与骨之间难以直接接触，从而未能达到理想的骨整合效果。已有研究证明，钛种植材料的表面参数，如表面粗糙度、形貌与元素等能够影响钛种植材料周围组织的细胞形态、细胞增殖、细胞粘附与基因表达，从而影响骨愈合的进程。为了提高相关性能，对钛种植材料进行表面改性是很有必要的，能有效提高钛种植体的植入成功率。

针对纯Ti 的应力屏蔽问题，目前已有提高负重延缓骨吸收、改进固定板对应力进行重分布、施加电流模拟压电效应以及从根本上降低材料的弹性模量等方法。由于纯Ti 弹性模量较高，α 型钛合金耐蚀性较差，人们通过在Ti 中添加Ni、Mo、Nb 等元素形成β 型钛合金，其中以Ti–Nb 和Ti–Mo 两种钛合金体系为主。合金元素的添加能有效降低钛及钛合金的弹性模量，从而避免应力屏蔽带来的影响，但合金元素的添加也会导致合金元素释出、引发人体炎症。因此，如何在兼顾强度与弹性模量的基础上，设计出生物相容性、细胞毒性等生物安全性指标达标的钛及钛合金，已成为了如今种植体的一个重要的研究方向。相关研究表明，对Ti–Ni 合金进行表面氧化、电解抛光、表面涂层、接枝活性分子等有助于提高其耐蚀性及生物相容性。相关领域研究者也越来越关注对纯Ti 进行表面改性，从而提高相关性能。

近年来，已有多家科研机构对此进行了探索。李俊等运用喷丸降低了纯Ti 表面的弹性模量。瑞士的Straumann 公司开发了喷砂酸蚀法（sand blasting and acid-etching method,SLA），运用大颗粒喷丸与HCl/HSO双酸酸蚀结合来对Ti 进行表面改性，已成功运用于临床医用且取得较好效果，此后该公司开发的SLActive（活性亲水SLA）工艺进一步提高了纯Ti 植入体的生物相容性并缩短了整体治疗周期。

二十世纪九十年代，卢柯等提出了表面机械研磨处理（surface mechanical attrition treatment，SMAT）。相较于传统喷丸处理，SMAT 能处理形状复杂的试件，且对材料表面损伤较小，并使材料的微观组织发生显著改变。对待处理材料表面进行的无规律高速撞击，使材料表面的晶粒细化至纳米级，而材料内部的晶粒保持原始大小，如此形成的梯度纳米层提高了材料表面与基体的结合程度。张保华等发现纯Ti 经SMAT 处理后，整体转变为梯度材料，弹性模量大幅度下降、动态弹性模量下降、强度和表面硬度提高、塑性下降。近年来，已有研究证明，对材料表面进行酸蚀能够促进材料表面细胞的粘附，并通过增加材料表面的亲水性来引导成骨细胞在表面的迁徙，从而促进新生骨的形成。目前已有研究者利用酸蚀工艺对SMAT 纯Ti 表面进行改性。骆雪等通过在36%～38%的HCl 环境中对SMAT 纯Ti 进行超声震荡15 min 并清洗，从而促进了MG63 细胞在SMAT 纯Ti 表面的增殖、粘附。朱珊珊等通过延长SMAT 纯Ti 在HCl 中超声震荡的时间，使SMAT 纯Ti 能够更好地促进人骨髓间充质干细胞在其表面的成骨分化。高飞等通过动物试验进一步探索了HCl 酸蚀后的SMAT 纯Ti 在生物体内对细胞成骨分化的促进作用，发现SMAT 纯Ti 可提高其表面新生骨的数量，并使得骨组织形态更为规则与致密。研究表明，纯Ti 表面在100 ℃的HCl 与HSO双酸酸蚀环境下能够形成增强骨引导的微米级粗糙结构，显著提高骨整合的速度与成功率，并降低骨吸收。然而，目前尚无针对SMAT 纯Ti 的酸蚀工艺，例如酸蚀液的浓度、酸蚀时间与酸蚀温度的具体探究。

正交试验分析方法作为基于正交性原理的试验方法，可大幅度减少多因素多水平试验的次数，并通过分析相应的K、k 值与R 值，从而对试验参数进行优化。本文以SMAT 纯Ti 作为分析对象，通过正交试验分析双酸液的酸蚀浓度、酸蚀时间与酸蚀温度对SMAT 纯Ti 表面形貌与生物性能的影响规律。

1 试验材料与方法

1.1 试样制备

试验采用南昌国材科技有限公司生产的厚度为5 mm 的Ti 板为研究对象，其中杂质元素Fe、C、N、H、O的质量分数分别为2×10%、1×10%、5×10%、2×10%、3×10%，其余皆为Ti。Ti 板通过如图1 所示的SMAT 装置进行处理。SMAT 参数如下：在液氮环境下，以50 Hz 的频率驱动直径8 mm 的不锈钢小球对纯Ti 表面进行60 min 的无序撞击。SMAT 后的Ti 板命名为SMAT 纯Ti，经过线切割制成5 mm×5 mm×1.5 mm 的SMAT 纯Ti 片。SMAT 纯Ti 片先后经过丙酮与无水乙醇超声清洗并干燥，去除表面油污与杂质。随后将SMAT 纯Ti 片浸入HCl 与HSO混合后的双酸酸蚀液中，在70～90 ℃的水浴环境下保温20～40 min，取出后再先后经过丙酮与无水乙醇超声清洗并干燥，经紫外灭菌后密封备用。

图1 SMAT 装置Fig.1 Device of SMAT

本试验采用三因素三水平的正交分析方法，所选的3 个因素分别为HCl 与HSO的浓度、酸蚀时间与酸蚀温度，通过控制水平的变化从而对工艺进行优化，试验因素与水平如表1 所示。

表1 正交试验因素及水平编码Tab.1 Orthogonal test factors and level codes

1.2 性能表征

采用接触角测量仪测试试样的亲疏水性；采用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)细胞试验测试试样的细胞毒性，所用的细胞为MC3T3-E1 细胞，采用多功能酶标仪测450 nm 波长处96 孔板内溶液的吸光度值，并与空白对照样进行比较，从而获得相应的相对吸光度值，评定标准为相对吸光度越高则试样的细胞毒性越低，即生物相容性越好；采用FEI Quanta 45扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察试样的微观组织；利用能量色散X 射线光谱仪表征试样表面所含元素。

2 实验结果与分析

2.1 试验参数对SMAT 纯Ti 接触角的影响

由于亲疏水性能够影响细胞粘附进而影响细胞分化，在生物试验中常作为细胞相容性的一个评判标准。较低的接触角通常与良好的细胞粘附与分化相联系。通过改变相关参数，获得具有更低接触角的试样表面，有助于对试样进行初步筛选，从而选出具备更好生物相容性的参数组合。

不同试验条件下测得的试样表面接触角值如表2 所示。K 可用于表述不同试验中的优势因素，k 可用于表述不同因素的优势水平。R 为所对应k1、k2、k3 的极差，可用于表述不同因素对试验值的影响，此处试验值为试样的接触角值。其中K1 行的3 个值分别为4.50 mol/L HCl 与6.72 mol/L HSO、酸蚀温度为70 ℃、酸蚀时间为20 min 时，所对应的3 次试验值之和；K2 行的3 个值分别为5.80 mol/L HCl 与8.96 mol/L HSO、酸蚀温度为80 ℃、酸蚀时间为30 min 时，所对应的3 次试验值之和；K3行的3个值分别为7.25 mol/L HCl 与11.20 mol/L HSO、酸蚀温度为90 ℃、酸蚀时间为40 min 时，所对应的3 次试验值之和。k1 行的值分别为4.50 mol/L HCl 与6.72 mol/L HSO、酸蚀温度为70 ℃、酸蚀时间为20 min 时，所对应的3 次试验值的平均值；k2 行的值分别为5.80 mol/L HCl 与8.96 mol/L HSO、酸蚀温度为80 ℃、酸蚀时间为30 min 时，所对应的3 次试验值的平均值；k3 行的值分别为7.25 mol/L HCl 与11.20 mol/L HSO、酸蚀温度为90 ℃、酸蚀时间为40 min 时，所对应的3 次试验值的平均值。

表2 正交试验参数与结果Tab.2 Parameters and results of the orthogonal test

由表2 中接触角值可知，8试样接触角值最小，亲水性最好；4试样接触角值最大，亲水性最差。由表2 中R 值可见，3 个因素按极差由大到小排序可得R1＞R3＞R2。由此可知，酸蚀浓度在本次正交试验中对接触角的影响最大，酸蚀温度次之，酸蚀时间影响程度最低。R1 与R3 相差较少，与R2 相差较大，可以得出酸蚀浓度与酸蚀温度对试样与水的接触角影响较大，酸蚀时间对试样与水的接触角影响最小。对k 值进行比较可以发现，随着双酸酸蚀浓度的增大与酸蚀温度的升高，试样与水的接触角呈现先增大后减小的趋势；随着酸蚀时间的延长，试样与水的接触角则表现为先减小后增大。对试验中3 个参数的变化进行比较，可以发现当酸蚀浓度为7.25 mol/L HCl 与11.20 mol/L HSO、酸蚀温度为90 ℃、酸蚀时间为30 min 时，为本次正交试验中接触角值最低的组合。

2.2 试验参数对SMAT 纯Ti 表面状态的影响

图2 为试样的SEM 图。由图2 可见，随着酸蚀时间的增加，试样表面的孔洞数量逐渐增多，整体起伏程度降低。由图2 中(a)、(f)、(h)可见，当酸蚀温度较低时，试样表面的孔洞深度较浅；由图2(b)、(d)、(i)与图2(c)、(e)、(g)可见，当酸蚀温度逐渐升高时，试样表面的孔洞深度逐渐加深。由图2(c)、(f)、(i)可见，当酸蚀时间为40 min 时，随着酸蚀浓度的增大、酸蚀温度先降低后升高时，试样表面的孔洞大小呈现先增大后缩小的趋势。通过对不同参数的比较与分析可以发现，酸蚀浓度对试样形貌的影响要比酸蚀时间与酸蚀温度的影响要大。

图2 不同试验参数下SMAT 纯Ti 酸蚀后的表面形貌Fig.2 Surface morphologies of the SMAT pure Ti after acid etching under different test parameters

表3 为不同试验参数下SMAT 纯Ti 酸蚀后的试样在能量色散X 射线光谱仪下测量得到的表面元素含量，测试范围为图2 表示的区域。由表3 可知，试样表面主要检测出作为基体的Ti 元素与在液氮环境下进行SMAT 处理后引入的少量N 元素，以及与空气接触形成氧化物后带入的微量O 元素，且无论试样处于何种酸蚀处理环境下，表面均未检出S、Cl 等有害元素。

表3 正交试验后试样表面元素含量Tab.3 Element contents of the sample surfaces after orthogonal test

2.3 试验参数对SMAT 纯Ti 生物相容性的影响

表4 为不同试验条件下试样的相对吸光度。由表4 可知，7试样的相对吸光度最高，表明7试样在本试验中具有最好的生物相容性，其次是9试样。分析k 值可以发现：随着酸蚀浓度的增加，试样的生物相容性也随之上升；酸蚀时间对试样的生物相容性的影响表现为，随着酸蚀时间的延长，试样的生物相容性先降低后缓慢上升；酸蚀温度对试样的生物相容性的影响表现为，随着酸蚀温度的升高，试样的生物相容性上升。通过比较k 值可知，当酸蚀浓度为7.25 mol/L HCl 与11.20 mol/L HSO、酸蚀时间为20 min、酸蚀温度为90 ℃，试样的生物相容性应为理论最优值。将该组参数与正交试验表进行对比可知，理论最优值对应的参数刚好可制得7试样。通过比较R 值的大小，可以发现R1＞R2＞R3，且R2与R3相差不大，R1相对R2 与R3 而言相差较大。由此可以推出酸蚀浓度对试样的生物相容性影响最大，酸蚀时间次之，酸蚀温度影响最小。

图3 为对表4 中的相对吸光度作图所得，其中0试样为未经SMAT 与酸蚀处理的纯Ti 试样，用于评价不同试验参数处理后SMAT 纯Ti 的生物相容性并进行比较。图3 中横线为0试样相对吸光度的75%，该值通常作为评价生物相容性是否合格的分界线。若材料经过处理后，其相对吸光度值高于对照样相对吸光度值的75%，即可认为该材料生物相容性合格，且相对吸光度值越大，材料的生物相容性越好。由图3 可得，与对照组相比，不同试验参数处理后SMAT 纯Ti 的生物相容性均有不同程度的提高，且均高于对照样相对吸光度的75%。这表明不同试验参数处理后SMAT 纯Ti 的生物相容性全部合格，且7试样的生物相容性远远高于其他试样。

图3 试验参数对酸蚀后SMAT 纯Ti 生物相容性的影响Fig.3 Effect of test parameter on the biocompatibility of SMAT pure Ti after acid etching

表4 正交试验参数与结果Tab.4 Parameters and results of the orthogonal test

3 结 论

（1）试验选用的酸蚀参数中，酸蚀浓度对试样的表面形貌、亲水性与生物相容性影响最大。剩余两个参数中，酸蚀温度对接触角的影响更大，酸蚀时间对生物相容性的影响更大。

（2）随着酸蚀浓度的增大与酸蚀温度的升高，试样的生物相容性都表现为一直提高；而随着酸蚀时间的延长，试样的生物相容性呈现先降低后提高的趋势。酸蚀浓度的增大，使试样表面的孔洞尺寸呈现出了先增大后减小的变化，而酸蚀温度的升高则使得试样表面孔洞的深度不断增加。

（3）本试验中的最佳试验参数即酸蚀浓度为7.25 mol/L HCl 与11.20 mol/L HSO、酸蚀时间为20 min、酸蚀温度为90 ℃，此时试样与水的接触角为63.5，相对吸光度为5.243。