咽炎片中(R，S)-告依春的含量测定

汪 安

(池州市质量监督检验研究院，安徽 池州 247000)

咽炎片由玄参、百部(制)、天冬、牡丹皮、麦冬、款冬花(制)、木蝴蝶、地黄、板蓝根、青果、蝉蜕、薄荷油 12 味中药材配伍组合而成，具有疏肝理气，健脾消食，养阴润肺，清热解毒，清利咽喉，镇咳止痒的功效，主要用于慢性咽炎引起的咽干、咽痒及刺激性咳嗽[1-2]。板蓝根始载于《神农本草经》，《中国药典》2020年版一部收载为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥根[3], 其作为常用抗病毒中药在咽炎片全方中用量较大。(R,S)-告依春为板蓝根抗病毒的代表性有效成分之一[4], 是反映板蓝根药材及其制剂质量的一个重要指标，虽已有文献报道过板蓝根提取物中(R,S)-告依春在大鼠体内的药代动力学研究[5], 但至今尚未有测定咽炎片中(R,S)-告依春含量的方法报道，通过对咽炎片中(R,S)-告依春的含量进行测定分析，能够有效鉴别和判断咽炎片的质量优劣。本研究参考《中国药典》及文献[6-10]，采用高效液相色谱法测定咽炎片中(R,S)-告依春的含量，以有效控制其内在质量，能够为咽炎片质量控制提供方法，保障用药安全。

1 仪器和试药

1.1 仪 器

岛津LC-2030A型高效液相色谱仪,日本岛津;XP205电子天平,梅特勒-托利斯仪器上海有限公司;Elma PH180H超声波清洗器,德国Elma公司。

1.2 药品与试剂

表1 咽炎片厂家与批号信息Table 1 Yanyan tablets manufacturers and batch number information

(R,S)-告依春(批号：111743-202007，纯度100%)，中检院;色谱甲醇,SIGMA 公司;磷酸、甲醇等试剂均为分析纯、超纯水、0.45 μm微孔滤膜,天津市津腾实验设备有限公司;咽炎片厂家与批号信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱: SHIMADZU C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相: 甲醇-0.02%磷酸 (7:93); 流速: 1. 0 mL/min; 柱温: 30 ℃; 检测波长: 241 nm; 进样量: 10 μL，以进行咽炎片中(R,S)-告依春含量的检测分析。

2.2 对照品溶液的制备

精确称量(R,S)-告依春对照品11.42 mg，放置于100 mL量瓶中，加5% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 的微孔滤膜进行过滤，得到浓度为 0. 1142 mg/mL 的对照品溶液。在该色谱条件下，对照品峰型良好，见图1。

2.3 供试品溶液的制备

取咽炎片20片，除去薄膜衣，称定重量，研细，精密称取1 g，放置于具塞锥形瓶中，精密加水25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在该色谱条件下，样品分离度较好，见图1。

图1 对照品(A)和样品(B)溶液的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of control (A) and sample (B) solutions

2.4 线性关系试验

分别精密量取“2.2”项下(R,S)-告依春对照品贮备液2、4、10、12、16、20 mL分别置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度依次递增的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行分析，测定对照品的峰面积，记录色谱图，以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制线性方程，计算得线性方程：以峰面积(Y)对溶液浓度(X)进行线性回归分析。得回归方程为：y=19225x+488912(r=0.9993)。结果表明(R,S)-告依春在 22.84～228.4 μg·mL-1内线性关系良好。实验结果证明对照品峰面积与浓度有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取“2.2”项下制得的对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果(R,S)-告依春的RSD为0.51%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

表2 样品稳定性含量变化Table 2 Sample stability content change

精密吸取“2.3”项下供试品溶液，分别于放置0、2、4、8、10、12、24 h后，注入高效液相色谱仪按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积。测定结果显示色谱峰平均峰面积为360855，RSD为 1.24%，表明供试品溶液在 24 h内基本稳定，随着时间的推移，供试品溶液中(R,S)-告依春的含量呈缓慢下降趋势。建议供试品制备后两小时上机分析，或者置于冰箱中保存，见表2。

2.7 重复性试验

取同一批号药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，记录峰面积并计算(R,S)-告依春含量及平均值。结果 (R,S)-告依春的平均含量为0.065 mg/片，RSD为1.72%，结果表明本法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的供试品(含量：0.065 mg/片)6份，样品按“2.3”项下操作制备供试品溶液，分别加入一定量的(R,S)-告依春对照品溶液，均匀混合，按“2.1”项下的色谱条件进样并测定含量，计算回收率，结果表明(R,S)-告依春的平均回收率为96.4%，RSD为0.72%，见表3。表明该方法加样回收率结果良好。

表3 (R,S)-告依春加样回收率试验数据Table 3 (R,S)-Gao Yichun sample recovery test data

2.9 样品含量测定

照“2.3”项制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，在“2.1”项下色谱条件下进样分析，测定峰面积，根据回归方程计算样品中(R,S)-告依春含量，见表4。结果表明石家庄东方药业生产的咽炎片中(R,S)-告依春含量较高。

表4 样品含量测定结果(n=3)Table 4 The content results of sample

3 讨 论

3.1 检测波长得选择

参考《中国药典》2020版一部板蓝根项下规定，检测波长245 nm，并根据文献[11-12]选择了235 nm和254 nm两种波长进行比较，利用二极管阵列检测器，预实验发现(R,S)-告依春在245 nm处有最大吸收，在上述色谱条件下，在245 nm处所得的HPLC图谱峰型较好，有利于分析。故在后续实验中选择245 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

参考《中国药典》2020版一部板蓝根项下选择甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作为流动相，并同时采用了了水-甲醇梯度洗脱以及甲醇-水 (15:85)两种方法的流动相，预实验结果显示甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作为流动相响应值良好，峰形佳，理论板数和分离度、基线等均符合要求，且效果优于水-甲醇梯度洗脱和甲醇-水 (15:85)这两种流动相，故在实验中选择了甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作为流动相。

3.3 提取方法的选择

在预实验中采取了加热回流提取和超声提取两种提取方法对咽炎片进行提取，结果表明超声提取对咽炎片的提取不够充分，加热回流提取效率高于超声提取，为了保证咽炎片内的有效成分能被充分、高效地提取出，故在后续实验中选择了加热回流作为咽炎片的提取方法。

4 结 论

通过上述实验方法，选定了市面上6个厂家生产的咽炎片作为供试品，对其(R,S)-告依春含量进行检测分析，结果显示选定的不同厂家的咽炎片中(R,S)-告依春含量范围为0.024～0.065 mg，含量差异较大，部分厂家生产的咽炎片中(R,S)-告依春含量较低。造成不同厂家生产的咽炎片含量差异较大的原因可能与各个厂家具有不同的生产工艺流程，且药材来源与质量等方面有关。由此可见，加强对市面上咽炎片中(R,S)-告依春的含量检测，有利于保障咽炎片的产品质量控制，确保其发挥更好的药效作用。

咽炎片的药品标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二册，但在中药成方制剂标准中未收载其有效成分含量测定的相关内容，咽炎片的现行质量标准滞后严重，缺乏专属性，无法保证用药的安全有效。目前，提高咽炎片的质量标准，增加专属性成分的检测，是控制其质量的有效途径。另外，中成药质量的源头，原料药材质量的控制更需有关部门进行严格把关，生产企业用质量合格的原料药材，严格按标准投料和生产，更是保证药品质量的关键。考虑(R,S)-告依春是板蓝根的主要活性成分之一，抗病毒作用明显，且含量较大，中国药典2020年版也收载了板蓝根中 (R,S)-告依春的含量测定方法，但至今尚未有测定咽炎片中(R,S)-告依春含量的方法报道，因此选择(R,S)-告依春作为咽炎片的质量控制成分，并首次建立了测定咽炎片中(R,S)-告依春的含量，并采用甲醇-0.02%磷酸 (7:93)作为流动相，该方法线性良好，精密度、准确度、稳定性及回收率均符合要求，可作为控制咽炎片中指标成分(R,S)-告依春的质量标准。