小檗碱通过激活Nrf2-HO-1/GPX4 通路抑制小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡

细胞死亡的类型根据细胞形态可以分为3种：自噬、凋亡以及细胞坏死。铁死亡是区别于以上3种细胞形态的新的细胞形态，它与铁离子水平相关，是由于脂质过氧化物产生而发生的。它的实质是氧化损伤，即主要为依赖铁离子的脂质过氧化物产生过量并积累，随后产生线粒体变化。线粒体功能障碍和异常的能量代谢是许多急性和慢性神经退行性疾病的常见上游介质。研究发现，多种疾病与铁死亡的关联紧密，如阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病。

神经退行性疾病是由神经元结构和功能的渐进性丧失或神经元死亡引起的疾病。大多数神经退行性疾病的发病机制尚不清楚，但越来越多的证据表明，神经退行性疾病的发病机制与兴奋毒素和氧化应激有关。HO-1是一种应激蛋白，参与抗氧化损伤的防御机制，其激活是许多神经退行性疾病的共同特征。HO-1蛋白的转录受Nrf2调控。抗氧化蛋白和铁代谢蛋白等与铁中毒有关的重要蛋白可提高Nrf2蛋白水平，促进基因转录。研究表明，当Nrf2及其靶基因被敲除时，Erastin或sorafenib会被激活，从而导致人肝细胞癌发生铁死亡。

为了更好的理解铁死亡在神经退行性疾病中的机制，我们研究了小檗碱在Erastin诱导HT22细胞铁死亡中的作用。小檗碱（BBR）是一种从天然植物黄连的根茎中提取出生物碱，含有抗氧化应激、降血糖、抗炎等药理作用，对包括脑缺血、多发性硬化症、各种神经退行性疾病在内的多种神经系统疾病具有神经保护作用。研究证实，Aβ能够导致原代海马神经元的损伤和凋亡，而小檗碱能够对抗此种损伤和凋亡。然而，对于小檗碱确切的神经保护作用机制还不够清楚。小檗碱的神经保护作用与铁死亡之间是否存在关联尚未有相关研究。因此本实验将小檗碱用于诱导铁死亡后的HT22小鼠海马细胞，观察其保护作用，并进一步探究其可能的作用机制，为阿尔茨海默病的治疗提供新的思路和靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 Erastin、小檗碱（MCE）；细胞计数试剂盒8（CCK-8）、HDCFH-DA溶液（非标记性的氧化敏感的荧光探针）（碧云天）；DAPI（Thermo fishe）；HO-1、GPX4、Nrf2和β-actin抗体（abcam）；BCA 试剂盒（碧云天）；TRIzol试剂盒购（Invitrogen）；两步法逆转录试剂盒（Vazyme）；SYBR qPCR试剂盒（Vazyme）。

1.1.2 细胞 HT22小鼠海马细胞（武汉赛诺普生命科技有限公司）由蚌埠医学院科研中心冻存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将小鼠海马细胞HT22放入培养箱培养，胎牛血清在培养基所占的比例为10%，并且同时加100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素于DMEM培养基中。传代用到的胰蛋白酶溶液的体积分数为0.25%，进行消化传代，比例约1∶2。

1.2.2 药物配制及处理 将Erastin 溶于DMSO，使其配为100 μmol/L 的溶液，实验使用时的最终浓度为0.5 μmol/L。相同方法使小檗碱配为1 mmol/L的溶液，实验使用时的最终浓度为30 μmol/L、60 μmol/L。ML385配置成2µmol/L。将实验分为两个部分，第1部分设置4个实验组，分别为完全培养基组、Erastin组、Erastin+30 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/L BBR组，小檗碱预处理2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin诱导8 h后进行相关实验。第2部分设置4个实验组：对照组、Erastin模型组、Erastin+60 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/L BBR+2 μmol/L ML385组，ML385预处理1 h，小檗碱预处理2 h，再加入0.5 μmol/L Erastin诱导8 h进行后序验证实验。

1.2.3 CCK-8 实验检测细胞存活率 96 孔板中种入7000个HT22细胞/孔，设置空白对照组（blank），正常对照组以及不同浓度的Erastin损伤模型组（0.05、0.1、0.5、1 μmol/L）作用细胞8 h。设置空白对照组，正常对照组，小檗碱（30、60 μmol/L）+0.5 μmol/L Erastin组，小檗碱预处理2 h，再加入Erastin作用8 h。随后每孔加入10 μL CCK-8溶液，随后放入培养箱培养30 min，每孔450 nm地方的吸光度数在酶标仪上读取。算出每组的细胞存活率。实验重复进行3次。

H2DCFH-DA测定细胞内ROS含量结果显示，和对照组相较，Erastin损伤模型组细胞内ROS含量增加，差异具有统计学意义（＜0.05）。和Erastin损伤模型组相较，小檗碱组可以减弱Erastin损伤下细胞内的ROS生成，60 μmol/L的小檗碱组的作用强于30 μmol/L组（图4）。

1.2.4 DAPI染色检测细胞凋亡水平 在24孔板里每孔种入5×10HT22细胞，放入培养箱培养，随后依次加入培养基、小檗碱预处理2 h后，0.5 μmol/L Erastin作用8 h，显微镜下观察细胞凋亡情况并拍照后吸除上清液，再加入PBS洗2遍。每孔加入200 μL 4%多聚甲醛，避光孵育30 min 后吸除4%多聚甲醛，且加入PBS 洗2遍。每孔加入100 μl DAPI溶液，避光孵育10 min，吸除DAPI溶液，再加入PBS洗2遍。将荧光显微镜调整参数后拍摄图片。最后分析各组结果。实验重复进行3次。

1.2.5 菲罗嗪法检测细胞内活性铁含量 按照上述药物配制及处理的分组分别分别对细胞进行不同处理后用胰酶消化以收集细胞，离心后取处理好的细胞，加入合适体积的RIAP裂解液在冰上裂解30 min，离心后提取细胞总蛋白。将上清液加入96孔板，并于每个加入上清液的孔里都加等体积的盐酸，室温放置30 min。孔中添加铁探针后，室温避光放置1 h。读取562 nm处吸光度数在酶标仪上。最后分析各组活性铁含量的结果。实验重复进行3次。

1.2.8 Western blot法检测蛋白表达 胰酶消化收集细胞，离心后弃去上清液，添加进去合适体积的RIAP裂解液在冰上裂解30 min，离心后以提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒，加入200 μL BCA溶液、19 μL NS和1 μL蛋白溶液，37°烘箱放置30 min，用酶标仪测定570 nm处的吸光度，加入RIAP裂解液进一步蛋白定量上清液，再添加5×SDS，95 ℃煮5 min。根据蛋白分子量配制不同浓度的分离胶，随后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量蛋白的蛋白样品，用甲醇激活PVDF膜，随后把蛋白转换至PVDF膜，用快速封闭液处理30 min后，数遍洗涤后，添加进去HO-1、GPX4、Nrf2、β-actin 抗体（按比例配制至所需浓度），4 ℃过夜，数遍洗涤后，加入二抗（按比例配制至所需浓度）并且在室温放置2 h 30 min，数遍洗涤后，ECL法使PVDF膜显影，曝光，以β-actin为内参基因，分析各组结果。实验重复进行3次。

夕阳无声地穿窗而入。鹅黄的冷光蒙在林强信蜡灰的脸上，像古铜色的面具。林老板的手掌又粗又厚，像个飞机场，飞机落在上面，似乎也能握碎。

1.2.6 H2DCFH-DA检测细胞内活性氧（ROS）含量 在12孔板里种入约1×10/孔HT22细胞，放入培养箱培养，随后按照上述药物配制及处理的分组分别进行不同处理后吸除药物，用无血清培养液清洗细胞2次，然后每孔添加进去用不加血清的培养基稀释至10 μmol/L的500 μL H2DCFH-DA溶液（非标记性的氧化敏感的荧光探针），放置在培养箱里30 min，用无血清培养液清洗细胞2次，随后将荧光显微镜调整参数后拍摄图片，最后分析各组结果。实验重复进行3次。

1.2.7 RNA提取及RT-qPCR法检测mRNA表达 用胰酶消化以收集细胞，离心后弃去上清液，每孔加入1 mL Trizol裂解细胞5 min后放置在-80 ℃冰箱。按照RNA提取步骤提取RNA，检测其浓度和纯度后，按RNA反转录试剂盒的进程逆转录；立即用于实验或-20 ℃保存。取稀释后cDNA用实时定量PCR试剂盒的进程检测细胞内HO-1、GPX4、Nrf2的mRNA表达。融解曲线为：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。所用PCR引物如下：ACSL4：Forward Primer：CCTGAGGGGCTTGAA ATTCAC，Reverse Primer：GTTGGTCTACTTGGAG GAACG；PTGS2：Forward Primer TGCACTATGGTT ACAAAAGCTGG，Reverse Primer TCAGGAAGCTC CTTATTTCCCTT；Nrf2：Forward Primer：CTCCTGG ACGGGACTATTGA，Reverse Primer:TGGGTCTCC GTAAATGGAAG；HO-1：Forward Primer：CACGCAT ATACCCGCTACCT，Reverse Primer：CCAGAGTGTT CATTCGAGCA；GPX4：Forward Primer：TGTGCATC CCGCGATGATT，Reverse Primer：CCCTGTACTTAT CCAGGCAGA。每组设置3个复孔，运用2的方法分析各组结果。实验重复进行3次。

课堂结构发生变革，学习与智能评测在前，教师依据课前评测分析，以学定教、分层教学，通过话题、小组讨论、课堂精讲等方式组织更加个性化的课堂教学在后。通过随堂练习及评测系统，进行实时测评、统计，快速分析与反馈学生的课堂学习效果，及时调整课堂教学进度与内容，体现了教师的教学机智，展示教师的教学艺术。[4]

菲罗嗪法检测细胞内活性铁含量结果显示，与对照组相较，Erastin损伤模型组里细胞内活性铁含量增加，为（68.34±4.16），差异具有统计学意义（＜0.05）。和Erastin 损伤模型组相较，小檗碱组铁含量降低为（38.98±3.85）（图3）。

与正常组相比，0.5 μmol/L Erastin诱导8 h能明显抑制细胞增殖（＜0.05），细胞存活率为（59±2.9）%，即在半数致死率IC附近（图1A）。因此选取最佳浓度是0.5 μmol/L Erastin造模。为探究小檗碱对Erastin诱导铁死亡的抑制作用，不同浓度小檗碱（30、60 μmol/L）预处理2 h后加入0.5 μmol/L Erastin，数据表明60 μmol/L小檗碱起到显著的保护作用（＜0.05），细胞存活率为（82.21±7.35）%（图1B）。

2 结果

2.1 小檗碱抑制Erastin诱导HT22细胞发生铁死亡

1.2.9 统计学处理 数据分析使用GraphPad Prism 8软件，均数±标准差来表示所有数据，两组数据相较采取检验分析，多组数据相较采取单因素方差分析（Oneway ANOVA），＜0.05表示差异有统计学意义。

2.2 小檗碱降低Erastin诱导的HT22细胞凋亡

接下来要说的是仿生学问题。正如前面所述，神经网络本质上仍然只是一个数学模型，是将思维活动简化为一种数据/信息处理过程的结果，这种简化不仅不符合认知科学对于延展认知乃至“泛”认知的理论假设，也同脑科学的最新发现不完全吻合。尽管信息处理仍然是认知科学的核心共识，但关于注意、记忆和行为控制方面的研究已经逐渐偏离了经典信息理论的框架。在人脑比较底层的对外界刺激的反映层面，神经网络能够证实的情况较多，而在高级思维活动如推理、概括等方面神经网络就显出不足。此外，人脑的神经元体系本身也是一个不断重建的结构，每时每刻都不断有神经元死去和出生，神经元之间的链接也在不断改变，这一过程无法完全由现有模型复制出来。

2.3 小檗碱降低Erastin损伤HT22细胞内活性铁含量

访谈对象是西北民族大学2012级藏语言文学专业个别同学和2011级藏语言文学3班（师范类）部分同学，通过滚雪球的方式选择了10位同学，由于访谈资料中有些问题涉及个人隐私，因此在访谈前，笔者首先与被访者进行了接触，取得信任后才正式进入到访谈阶段，而且还利用了网络聊天工具（QQ聊天平台）进行网络访谈，每位参与者在了解研究的性质后自愿参加，能够对自己所持的婚恋态度及对婚姻的认识给予合理的解释。访谈地点一般选在无人的教室或食堂内，时间不定。访谈时若被访者已有恋爱对象，则选择其恋爱对象不在场，以免影响被访者真实想法的表达。

DAPI染色前，普通显微镜观察不同组细胞凋亡情况发现，与对照组相较，Erastin损伤模型组里细胞凋亡明显增加（＜0.05），同时，不同浓度的小檗碱均降低Erastin诱导的凋亡（图2A）。DAPI染色后，荧光显微镜拍摄图片并且统计各个组内凋亡水平，结果显示，0.5μmol/L Erastin诱导8 h凋亡率为（25.77±2.05）%，而60 μmol/L小檗碱保护后凋亡率为（10.72±1.93）%（图2B）。

2.4 小檗碱降低Erastin损伤HT22细胞内ROS含量

从主管部门的未来水权改革设想来看，似乎设想的所谓水权交易也不过是取水许可的交易，仍不是真正的水权交易，因为取水许可是一种暂时的行政许可，既不是产权，也有时效限制。

2.5 小檗碱影响Erastin损伤HT22细胞中Nrf2-HO-1/GPX4/ACSL4/PTGS2 mRNA表达

和对照组相较，Erastin组中表达量下调的有HO-1、GPX4、Nrf2 mRNA，表达量上调的有ACSL4、PTGS2 mRNA，而与Erastin组比较，Erastin+BBR组的HO-1、GPX4、Nrf2 mRNA 表达量增高，尤其是60 μmol/L小檗碱组；ACSL4、PTGS2 mRNA 表达量降低，尤其是60 μmol/L小檗碱组（＜0.05，图5）。

2.6 小檗碱对Erastin 损伤HT22 细胞中Nrf2-HO-1/GPX4蛋白表达的影响

与对照组相较，Erastin组的Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的表达量减少，而与Erastin 组比较，Erastin+BBR组的HO-1、GPX4与Nrf2蛋白的表达量增加，特别是60 μmol/L小檗碱组（＜0.05，图6）。

“旅游、建设、发展”3个词汇的占比较之其他高出许多，且近3年呈现逐年大幅增长的趋势，说明历史文化村镇的建设和经济发展受到专家的关注的程度越来越高。较之“资源保护”，“活化利用”在历史文化村镇保护工作中占比越来越大。“旅游”一词热度居于首位，说明旅游成为历史文化村镇近年来发展的一个重要方向。

2.7 Nrf-2 抑制剂逆转小檗碱对HT22细胞的保护作用

在60 μmol/L小檗碱的基础上增加了Nrf2抑制剂组，结果发现，Nrf2抑制剂ML385可以抑制Nrf2-HO-1/GPX4/通路的激活，并且使HT22细胞内活性铁含量和ROS含量增加，逆转了小檗碱对HT22细胞的保护作用（＜0.05，图7）。

3 讨论

小檗碱具有抗炎、抗氧化、保护神经等作用。小檗碱作为一种中药单体临床使用安全有效。研究证明其对慢性脑灌注不足大鼠的CBF降低和认知功能障碍有良好的改善作用。本实验中，我们首先使用不同浓度的Erastin观察对细胞的增殖抑制作用，结果发现0.5 μmol/L Erastin显著抑制HT22细胞增殖，而给与小檗碱保护后，Erastin抑制HT22细胞增殖作用降低。在细胞凋亡实验中观察到了同样的结果。Stockwell等发现铁死亡是一种新的死亡形式，与多种疾病密切相关。其中四个关键因素，铁、PUFAs、氧气、抗氧化剂的减少是诱发铁死亡的必要因素。因此，我们检测了药物小檗碱处理后Erastin损伤HT22细胞内活性铁含量以及ROS的水平，结果发现，小檗碱能够降低Erastin损伤HT22细胞内活性铁含量以及ROS水平。

GPX4 是铁死亡标志蛋白，铁死亡发生时GPX4表达减少。长链酯酰辅酶A 合成酶家族（ACSLs）是负责机体内脂肪代谢的关键酶，是代谢相关疾病的重要调控因子。近期研究发现ACSL4可以促进花生四烯醇（AA）和肾上腺素醇的酯化生成PE，这一过程与铁死亡密切相关。Cheng等的研究发现，ACSL4通过激活铁死亡抑制胶质瘤细胞的增殖。在铁死亡过程中伴随ACSL4表达增加，因此通常作为铁死亡的标志物。前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2），又称环氧化酶2（COX-2），也是公认的铁死亡标志物。本实验表明，小檗碱降低Erastin诱导的神经元细胞HT22的铁死亡标志物ACSL4、PTGS2的表达，增加GPX4的表达。以上结果说明小檗碱可以降低Erastin在HT22细胞中诱发的铁死亡。这与关等人之前的研究，小檗碱缓解高糖状态下足细胞发生铁死亡一致。

Nrf2-HO-1/GPX4通路与抗氧化作用密切相关，转录因子Nrf2是抗氧化系统的主要调控因子，在介导铁/金属代谢、脂质代谢和谷胱甘肽合成方面也发挥着关键作用，GPX4，and HO-1，受Nrf2调控，从而发挥抗氧化作用，以上因子都涉及铁死亡的发生。本研究实验表明，小檗碱增高Nrf2-HO-1/GPX4通路相关基因与蛋白的表达，说明小檗碱能够抑制HT22细胞铁死亡，其机制可能与Nrf2-HO-1/GPX4信号通路的调节有关。为进一步验证这一结论，又使用了Nrf2抑制剂来观察对小檗碱保护作用的影响，结果发现，Nrf2抑制剂可以抑制Nrf2-HO-1/GPX4通路的激活，并且增加了HT22细胞内铁离子和ROS含量。

(1) 由钢管塔的模态分析可以看出,钢管塔的上横担和地线横担容易发生扭转变形,地线横担发生的变形尤为严重.

综上所述，本研究结果证实了小檗碱对神经元HT22细胞中Erastin诱导的铁死亡具有明显的抑制作用，而机制可能作用于Nrf2-HO-1/GPX4通路实现。