基于核磁共振技术对亚麻籽油进行脂肪酸组成检测与品质鉴别

李 刚，康 乐，何建昇，张 松

(山西省科技资源与大型仪器开放共享中心，太原 030012)

亚麻籽油是从亚麻籽中提取的食用油，其富含α-亚麻酸[1]，具有很高的营养价值[2]。亚麻籽生性喜寒耐寒，适合生长在我国西部、北部高寒干旱地区。亚麻籽是山西省北部地区特产[3]，山西省兴县峁底村亚麻籽油压榨技艺和神池梁榨亚麻籽油技艺被评为山西省省级非物质文化遗产。植物油中脂肪酸检测常用的方法气相色谱(GC)法[4-6]和气相色谱-质谱联用(GC-MS)法[7-9]前处理烦琐，检测成本较高，实验过程复杂，耗时较长，而基于核磁共振技术检测植物油脂肪酸，样品无需预处理，可以实现快速检测[10-17]。

山西省市场上正规厂家生产的亚麻籽油，压榨原料为纯亚麻籽，而某些小油坊在原料中可能会掺入压榨工艺类似的黄芥、油菜籽等油料，降低了亚麻籽油的品质。为此，本文首先采用GC-MS分析了纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油的脂肪酸组成，确认掺杂亚麻籽油除含有亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸外，还含有单不饱和脂肪酸花生一烯酸和芥酸。再运用核磁共振谱仪确认花生一烯酸和芥酸1H NMR和13C NMR特征峰，从而可快速判别亚麻籽油是否掺杂，为亚麻籽油品质鉴别提供参考。最后采用1H NMR法计算亚麻籽油中脂肪酸含量，并与国标GC法进行了对比。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

亚麻籽油：从山西北部亚麻籽油生产厂家采集了3种不同品牌的亚麻籽油，编号分别为L1、L2、L3；从小油坊中采集了3种亚麻籽油，编号分别为M1、M2、M3。

花生一烯酸甲酯标准品(CAS号为2390-09-2，100 mg)，美国NU-CHEK公司；芥酸甲酯标准品(CAS号为1120-34-9，100 mg)，美国Accustandard公司；异辛烷(分析纯)，天津市申泰化学试剂公司；甲醇(色谱纯)，美国奥泰科技有限公司；无水硫酸钠，天津市天大化工实验厂；氢氧化钾(分析纯)、硫酸氢钠(优级纯)，天津市光复精细化工研究所；氘代氯仿(CDCl3，氘代率99.8%，批号174611)，百灵威科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

Bruker 600 MHz AVANCEⅢ NMR Spectrometer、Bruker 400 MHz AVANCEⅢ NMR with Autosampler 、5 mm核磁管，德国布鲁克公司；Thermo TSQ 8000 Evo GC-MS；ZKAT-20M色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；Agilent 7890B GC； Agilent DB-wax色谱柱(30 m×320 μm×0.5 μm)。

1.2 实验方法

1.2.1 GC-MS分析

样品前处理：称取60.00 mg油样于具塞试管中，加入4 mL异辛烷溶解，必要时可以微热使样品溶解，再加入200 μL质量分数为2%的氢氧化钾甲醇溶液，盖上玻璃塞猛烈振摇30 s后静置澄清。向试管中加入约1 g硫酸氢钠，猛烈振摇，待盐沉淀后，将上层溶液移至上机瓶中待测。

GC-MS条件：升温程序为初始柱温60℃，以4℃/min升至250℃，保持15 min；进样口温度250℃；进样量1 μL；分流比10∶1；离子源(EI)温度250℃；质量扫描范围33～500 u；溶剂延迟时间4 min。

1.2.21H NMR分析

样品前处理：取5 μL样品于离心管中，加入600 μL含四甲基硅烷(TMS)的CDCl3(氘代率99.8%)，用涡旋混匀仪充分混匀，转移至5 mm核磁管待测。

仪器测试条件：温度300 K；频率600.13 MHz；氢谱宽度12 335.5 Hz；扫描12次；延迟时间d1 20 s；谱图处理时以TMS定位，数据采用Mestrenova软件处理。

1.2.313C NMR分析

样品前处理：处理方法同1.2.2，标准品取样30 μL，亚麻籽油取样80 μL。

仪器测试条件：温度295.8 K；频率400 MHz；氢谱宽度102 700 Hz；扫描32次；延迟时间d1 2 s；谱图处理时以TMS定位，数据采用Mestrenova软件处理。

1.2.4 GC分析

GC分析参考文献[4]。样品前处理：处理方法同1.2.1。

GC条件：升温程序为柱温60℃，以4℃/min升至250℃，保持15 min；进样口温度220℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；进样量1 μL。采用外标法定量。

2 结果分析

2.1 纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油脂肪酸组成的确认

运用GC-MS分别对6个样品进行测试，得到纯亚麻籽油(L1、L2、L3)和掺杂亚麻籽油(M1、M2、M3)的总离子色谱图(由于纯亚麻籽油谱图各峰都一致，只是强度不同，定性分析时任选一谱图即可；掺杂亚麻籽油谱图选择同理。下同)，如图1所示。

由图1可见，正规厂家生产的纯亚麻籽油中主要含有棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸( C18∶1)、亚油酸(C18∶2)和亚麻酸(C18∶3)，而小油坊生产的亚麻籽油中除上述脂肪酸外，还含有花生一烯酸(C20∶1)和芥酸(C22∶1)。通过实际调研和查阅文献[18]可知，掺杂亚麻籽油中花生一烯酸和芥酸主要是由当地产的黄芥、油菜籽等油料混入产生的。

图1 纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油的GC-MS总离子色谱图

2.2 亚麻籽油1H NMR图谱及特征峰归属

纯亚麻籽油1H NMR谱图如图2所示。为方便确认掺杂亚麻籽油特征峰及对亚麻籽油中脂肪酸进行定量分析，根据食用油核磁共振特性及相关资料[19]，对纯亚麻籽油1H NMR特征峰进行归属，结果见表1。

图2 纯亚麻籽油1H NMR谱图

表1 纯亚麻籽油1H NMR特征峰归属

2.3 掺杂亚麻籽油中花生一烯酸和芥酸1H NMR特征峰的确认

花生一烯酸甲酯标准品和芥酸甲酯标准品的1H NMR谱图如图3所示，谱图中特征峰的归属如表2所示。由表2 可见，花生一烯酸甲酯和芥酸甲酯的1H NMR谱图中特征峰为烯丙基质子氢，化学位移(δ)在1.99～2.03之间。

图3 花生一烯酸甲酯标准品和芥酸甲酯标准品 1H NMR谱图

表2 花生一烯酸甲酯标准品和芥酸甲酯标准品1H NMR特征峰的归属

测定了纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油1H NMR谱图，并重点比较了二者在化学位移为1.98～2.04区间的1H NMR特征峰，结果如图4所示。

图4 纯亚麻籽油与掺杂亚麻籽油在化学位移为1.98～2.04的1H NMR谱图

由图4可见， b峰与f峰、c峰与g峰 、d峰与h峰重叠，且在纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油中都存在，而a峰和e峰只在掺杂亚麻籽油中出现，对比表2，可确认掺杂亚麻籽油中a峰为花生一烯酸特征峰，e峰为芥酸特征峰。

2.4 掺杂亚麻籽油中芥酸和花生一烯酸13C NMR特征峰的确认

花生一烯酸甲酯标准品和芥酸甲酯标准品13C NMR谱图如图5所示，谱图中双键位置特征峰的归属如表3所示。

图5 花生一烯酸甲酯标准品和芥酸甲酯标准品的13C NMR谱图

表3 花生一烯酸甲酯标准品和芥酸甲酯标准品的13C NMR谱图中双键位置特征峰的归属

由表3可见，花生一烯酸和芥酸的13C NMR特征峰的化学位移在129附近，与脂肪酸碳链中13C NMR双键谱峰多出现在化学位移129.8～130.1区域[20]的研究结果一致。测定了纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油的13C NMR谱图，并重点对比了二者在化学位移129.8～130.1区间的13C NMR特征峰，结果如图6所示。由图6可见，p、q、r、s 4个峰只在掺杂亚麻籽油中出现，再与表3对比，可确认掺杂亚麻籽油中p、q峰为花生一烯酸的特征峰，r、s峰为芥酸的特征峰。

图6 纯亚麻籽油与掺亚麻籽油在化学位移为129.8～130.1区间的13C NMR谱图

综上，基于核磁共振技术，根据1H NMR中a峰和13C NMR中p、q峰可以判定亚麻籽油中是否含有花生一烯酸，根据1H NMR中e峰和13C NMR中r、s峰可以判定亚麻籽油中是否含有芥酸，从而可以快速鉴别亚麻籽油中是否掺杂。

2.5 亚麻籽油中脂肪酸的定量分析

对亚麻籽油1H NMR特征峰准确归属后，参考文献[19]按式(1)～式(4)定量计算亚麻籽油中亚麻酸、亚油酸、单不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸的含量。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：Y3为亚麻酸含量；Y2为亚油酸含量；A、B、E、G分别对应表1中相应谱峰的积分值；Y1为油酸、花生一烯酸等单不饱和脂肪酸的含量；Y0为棕榈酸和硬脂酸等饱和脂肪酸的含量。为提高1H NMR法定量计算各脂肪酸的准确性，通过取少量样品，实验中增大延迟时间d1实现。

表4和表5分别为采用GC法(按1.2.4方法)和1H NMR法测定的纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油的各脂肪酸含量。

表4 GC法纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油脂肪酸含量 %

由表4、表5可以看出：纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油中1H NMR法计算的亚麻酸含量与GC法一致，相对误差均小于1%，结果准确可靠；其他脂肪酸含量与GC法相比有一定误差，仅可作为参考。纯亚麻籽油中亚麻酸含量在50%以上，而掺杂亚麻籽油中亚麻酸含量显著降低。以亚麻酸含量评价亚麻籽油的品质，亚麻酸含量越高亚麻籽油品质越好。基于1H NMR技术计算亚麻籽油中亚麻酸含量可以鉴别亚麻籽油品质。

表5 1H NMR法纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油脂肪酸含量 %

3 结 论

本实验基于核磁共振技术对亚麻籽油脂肪酸组成进行了检测和品质鉴别。运用GC-MS法分析了掺杂亚麻籽油比纯亚麻籽油中多含有芥酸和花生一烯酸，再运用核磁共振谱仪确认掺杂亚麻籽油中花生一烯酸、芥酸的1H NMR和13C NMR特征峰，作为纯亚麻籽油和掺杂亚麻籽油快速判别的方法。采用1H NMR法定量计算亚麻籽油中脂肪酸含量，并运用GC法对比其准确性，结果表明，1H NMR法计算的亚麻酸含量准确可靠，以此可定量分析亚麻籽油的亚麻酸含量，并鉴别其品质。基于NMR技术对亚麻籽油脂肪酸组成进行检测，可快速鉴别亚麻籽油品质。