用于糖类分子识别的硼酸盐亲和材料

李孝龙 李玲玲

摘要：糖类分子在许多生理和病理过程中作为识别决定因素发挥着关键作用。由于糖类分子普遍存在顺式二醇结构，因此利用基于硼酸的亲和材料用于选择性分离和富集含顺式二醇的生物分子，近年来越来越受到关注。本文综述了影响硼酸盐亲和材料性能的主要因素、新型硼酸盐亲和材料的性能改进、基于硼酸的荧光糖传感器，并讨论了硼酸盐亲和材料在唾液酸诊断方面的进展。

关键词：糖类、硼酸、硼酸盐亲和材料、唾液酸

1 简介

糖类（碳水化合物）在自然界中无处不在，从简单的单糖、双糖到由数个、十、百、甚至数千、数万个单糖组成的复杂多糖、聚糖，这些糖分子具有各式各样的结构，发挥了各种各样的作用。例如，用于维持细胞正常生理功能的血糖;作为遗传信息RNA和DNA骨架成分的五元核糖、五元脱氧核糖;用于治疗各种细菌感染的一类抗生素氨基糖苷，是氨基修饰糖;而多糖、聚糖通常作为许多生理和病理过程的识别决定因素和调节剂发挥着关键作用，包括细胞信号、细胞生长、细胞分化和肿瘤发生等[1]。

2 硼酸盐亲和材料

糖类中普遍存在顺式-1，2-和-1，3-二醇结构，都可被硼酸可逆的结合，此思路常被用于设计和实现多种糖类的生物传感器。此外，含顺式二醇的糖类分子在生物系统中常以低丰度存在，通常伴有高丰度的其它干扰组分。因此，硼酸盐亲和材料，可选择性分离和富集含顺式二醇的生物分子，近年来越来越受到关注。

2.1影响硼酸盐亲和材料结合特性的关键因素

影响硼酸盐亲和材料对目标分子的识别、分离的关键因素有结合pH值、亲和性、选择性[2]。

2.1.1结合pH值

虽然硼酸及其衍生物的总数超过1500种，但适用于硼酸盐亲和材料的只有少数，其中3-氨基苯基硼酸（APBA， pKa = 8.8）和4-乙烯基苯基硼酸 （VPBA， pKa = 8.2）的使用最广泛。传统的硼酸亲和材料只能在碱性pH下正常工作。而血液、泪液、尿液、唾液等常见生物样品的pH值范围为4.5～8.0，应用于这类样品时需要调整样品溶液为碱性pH，这不仅带来不便，还有不稳定的生物分子降解的风险。

2.1.2 亲和力

与目标分子的结合常数，决定了亲和材料可有效捕获的样品中目标分子的最低浓度。硼酸与糖或糖蛋白之间的解离常数Kd范围为10-1至10-3 M。由于含顺式二醇的生物分子的浓度通常较低，传统的硼酸盐亲和材料有效捕获它们较为困难。

2.1.3选择性

使用传统硼酸盐亲和材料，在良好选择性的捕获目标糖蛋白方面尤其具有挑战性。一个主要原因是在传统硼酸盐亲和材料的设计和应用中，很难考虑到控制选择性的多种力的协同作用。为了使亲和材料具有良好的选择性，对各种力的共同作用的充分理解是必不可少的。

为了解决上述关键问题，人们设计、制备了一系列新型硼酸盐亲和材料，从而实现了生物样品有效捕获的实际应用，具有很好的前景。

2.2 新型硼酸盐亲和材料

2.2.1 低结合pH的硼酸盐亲和材料

四种类型的硼酸可以提供低结合pH值，包括：（I）苯环上带有吸电子基团的苯基硼酸，如磺酰基、氟基和羰基。携带吸电子基团的硼酸具有增加的酸度和降低的pKa值，硼酸配体的pKa值越低，其结合pH值越低，结合亲和力越高。（II）含有分子内四配位B−N或B−O键的硼酸（Wulff型）。Wulff型硼酸含有分子内四配位B−N或B−O键，可促进四方硼酸盐阴离子（sp3）的形成，sp3杂交状态即使在中性或中度酸性条件下也保持稳定，有利于硼酸盐与顺式二醇的酯化反应。（III）含有分子内三配位B−O键的硼酸（改良的Wulff型）。例如苯丙硼酸盐是改良的Wulff型硼酸，它具有优异的水溶性和更好的糖结合能力。（IV）杂环硼酸。杂环硼酸由于环中存在杂原子，表现出明显低的结合pH值。例如3-吡啶基硼酸的pKa值为4.4，它允许在低至4.5的pH值下选择性结合含顺式二醇结构的化合物，这样的结合pH值能够在不调整样品pH值的情况下从尿液样本中富集含有顺式二醇的生物分子，例如核苷。

2.2.2 高亲和力的硼酸盐亲和材料

对于某些硼酸配体，即使在最适pH值下，其对含顺式二醇的生物分子的亲和力仍然很低，因此亲和力增强策略非常重要。通常地，利用多价结合策略，如使用树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子（MNP），能有效增强其与糖蛋白的结合。然而，对于只含有一个顺式二醇的糖分子，如单糖和核苷，多价结合策略并不适用。因此，纳米限制效应作为一种亲和力增强策略应运而生。

通过对限制在硼酸盐亲和性介孔二氧化硅纳米颗粒内的分子相互作用进行定量研究，观察到分子间的相互作用被限制和增强取决于被约束程度，在高限制条件下（1.5nm大小的糖蛋白RNase B限制在2.1nm硼酸盐亲和纳米孔中），与非限制性条件相比，亲和性增强了3个数量级。而在较少限制下（腺苷，一种只含一个顺式二醇的小分子，限制在2.6nm的孔中），硼酸盐亲和力仅提高了7.5倍。這一发现意味着，当目标分子被限制在与其3D形状互补的空间中时，纳米限制效应将最大限度地增强结合强度[3]。

将多价结合和纳米限制效应两种策略联合起来，纳米限制亲和材料应运而生。纳米限制亲和材料依赖于多孔材料的限制效应，为分子大小与孔径相当的蛋白质提供关键亲和力，从而实现了高丰度血清蛋白质的去除、手性分离和固定化酶反应器等有前景的应用。

2.2.3 良好选择性的硼酸盐亲和材料

研究表明，硼酸盐亲和材料还可能发生多个次级相互作用，主要包括疏水作用、离子作用和氢键。因此，硼酸盐亲和材料获得良好选择性涉及两个方面：一方面，强的硼酸盐亲和力相互作用是至关重要的，对于这一点，具有较高亲和力和较低结合pH值的硼酸配体必不可少;同时，路易斯碱的参与可以增强亲和力，从而提高选择性。另一方面，应该抑制不利的二次相互作用。

通过巧妙的设计，二次相互作用也可以成为有利因素，这使得硼酸盐亲和分离后的二次分离成为可能。利用氢键作用作为二次分离的主要驱动力，设计的高度亲水性的硼酸盐亲和整体柱，使顺式二醇化合物能够在单个色谱柱中进行二维分离。第一个维度的分离是硼酸盐亲和分离，其中含有顺式二醇的化合物在柱上被延迟，当延迟化合物用酸性溶液洗脱时，延迟部分中的组分根据它们与色谱柱的氢键作用进一步分离。

尽管结合性能大大提高的各类新型硼酸盐亲和材料已显示出巨大的应用前景，但它们仍存在两个局限性：一是它们的类选择性，使它们无法识别特定的含顺式二醇的化合物。二是大多数材料的亲和力仍然相对较差。因此，分子印迹自然成为一种有效的解决方案。

3 硼酸盐亲和分子印迹聚合物

分子印迹聚合物（MIPs）是在模板分子存在下通过聚合特定的功能单体后洗脱模板制备而得的高分子聚合物，是具有抗体样结合特性或酶样催化活性的重要功能材料，从传感到分离再到催化都有广泛的应用。由于存在与模板分子高度互补的纳米级印迹空腔结构，MIPs对模板分子具有极好特异性和高亲和力，这非常适用于在复杂样品中对分析物的分子识别和分离。一般来说，有两种分子印迹方法，Wulff提出的共价印迹和Mosbach提出的非共价印迹[2]。非共价印迹法在选择功能单体和可能的模板分子方面更灵活;而且操作简单，因为只需要混合功能单体和模板。然而，由于预聚复合物中存在平衡体系，非共价印迹可能产生一定的结合位点异质性。相比之下，由于共价键更稳定，共价印迹产生更均匀的结合位点分布。此外，在共价印迹中，模板分子结合位点的结构更清晰。由于硼酸的易开/关反应性有利于模板的印迹和去除，因此硼酸已成为用于共价印迹含顺式二醇化合物的功能单体。

自从Wulff及其同事首次报道基于硼酸盐亲和力的小分子印迹以来，已经制备了许多针对单糖和核苷酸等小分子的MIPs。生物大分子，尤其是蛋白质的印迹更具挑战性。这是因为蛋白质的大尺寸使其难以从高度交联的聚合物网络中去除，同时因为用于印迹的苛刻聚合条件导致蛋白质构象变化。为了克服这些问题，人们提出了许多印迹策略，包括表面印迹、表位印迹、Pickering乳液、金属配位、分层印迹等。

4 荧光硼酸糖传感器

1994年，Shinkai及其同事用蒽报告基团增强了硼酸结合基序，从而产生了第一个荧光（邻-（氨基甲基）苯基）硼酸糖传感器，它可逆地与二醇结合形成硼酸酯。光诱导电子转移机制似乎最有可能解释观察到的荧光变化，在没有分析物的情况下，N-B相互作用很弱，氮上的孤对电子可用于淬灭荧光团的荧光，然而，在结合糖类后，硼的酸度增加，与胺的孤对电子产生更强的路易斯相互作用，降低其猝灭效应并显示出蒽的固有荧光[4]。虽然一直以来，对含有（邻-（氨基甲基）苯基）硼酸糖传感器中的荧光开启机制缺乏完整和统一的解释，但这并不影响研究人员们开发具有硼受体的碳水化合物传感器。

5 硼酸盐亲和材料在唾液酸诊断方面的应用

唾液酸是一类带负电荷的，含9个碳原子骨架的，被称为神经氨酸的酸性氨基单糖N-或O-衍生物的总称。主要包括N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）、N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）和脱氨神经氨酸（KDN）3种核心结构。唾液酸广泛分布于真核细胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖链的最末端，是细胞膜上糖蛋白、糖脂的重要组成成分[5]。

唾液酸在多种癌症中过度表达，是癌症诊断中使用的重要生物标志物。因此，硼酸的二醇识别能力使硼酸盐亲和材料能够用于检测唾液酸类的癌症生物标记物。通过对苯硼酸的不同共轭和掺入，Ouchi等人开发了4种基于角鲨烯和菁的荧光传感器分子。这4种荧光传感分子的侧链烷基均可与N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）相互作用，但由于侧链烷基长度不同，所以形成具有不同排放曲线的结构不同的聚集体。临床上，含有不同浓度（0.3、2.0、6.0和20.0 mM）N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）的尿液，代表了人类从健康到严重疾病的状态，因此这4种荧光传感器分子可被用来做判别分析[4]。这是Neu5Ac 选择性化学传感器的第一个例子，虽然该方法限制了一些实际应用，但研究结果已经显示了硼酸盐亲和材料在基于唾液酸分析应用于肿瘤领域分子诊断方面的的巨大前景。

6 总结

硼酸因其能够可逆的结合二醇，已被用于各种不同硼酸盐亲和材料的制备。硼酸盐亲和材料在亲和分离、代谢组学、疾病诊断等方面有着成功的应用，随着进一步的研究，硼酸盐亲和材料将有更广泛的应用前景。如近年来兴起的、用于糖类检测的化学传感器的开发，将硼酸盐亲和材料与信号报告等其他理想材料相结合，是未来的一个重要发展方向。

参考文献：

[1]Tommasone S ， Allabush F ， Tagger YK ， Norman J ， Köpf M ， Tucker JHR ， Mendes PM . The challenges of glycan recognition with natural and artificial receptors. Chem Soc Rev. 2019 Nov 11;48（22）：5488-5505.

[2]Li D， Chen Y， Liu Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition： structure， properties and applications. Chem Soc Rev. 2015 Nov 21;44（22）：8097-123.

[3]Liu Z， He H. Synthesis and Applications of Boronate Affinity Materials： From Class Selectivity to Biomimetic Specificity. Acc Chem Res. 2017 Sep 19;50（9）：2185-2193.

[4]Williams GT， Kedge JL， Fossey JS. Molecular Boronic Acid-Based Saccharide Sensors. ACS Sens. 2021 Apr 23;6（4）：1508-1528.

基金項目：湖北省教育厅科学技术研究计划指导性项目（B2018421）。

作者简介：李孝龙（2000-），男，湖北，武汉文理学院医学院药学专业本科在读学生。

通讯作者：李玲玲（1982-），女，陕西，讲师，硕士，研究方向：高分子材料。