淫羊藿黄酮苷类化合物生物转化的研究进展

张宇航 陈旺 冯自立 袁洪超 高小林 王翠萍

关键词淫羊藿;黄酮苷类化合物;低糖苷类化合物;生物转化

淫羊藿（Epimedii Folium）是我国传统中药材，2020年版《中国药典》（一部）收录的淫羊藿品种有淫羊藿Epimediumbrevicornum Maxim.、柔毛淫羊藿E. pubescensMaxim.、箭叶淫羊藿E. sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、朝鲜淫羊藿E. koreanum Nakai 4 个品种，具有滋补肾阳、祛除风湿、强壮筋骨等药理作用[1-2]。黄酮苷类化合物是淫羊藿及其同属植物的主要活性成分，通常可根据其黄酮母核上的糖基数目分为多糖苷类化合物（含3 个及以上糖基）朝藿定A、朝藿定B、朝霍定C和低糖苷类化合物（含2 个或1 个糖基）淫羊藿苷或宝藿苷Ⅰ[3]。研究表明，淫羊藿低糖苷类化合物具有类雌激素和抗氧化等多种药理作用，且活性强于多糖苷类化合物，这主要是由于低糖苷类化合物在人体内的生物利用度较多糖苷类化合物更优[4-7]。可见，黄酮苷类化合物糖链的多寡在很大程度上影响了该类化合物的生物活性。但淫羊藿及其同属植物中高活性低糖苷类化合物的含量通常较低，不能通过常规分离纯化的方法大量制备[8-9]。基于此，本研究对淫羊藿黄酮苷类化合物生物转化技术的研究进展进行综述，旨在为该类化合物的制备提供参考。

1 酶水解法制备淫羊藿低糖苷类化合物

已有大量文献报道，淫羊藿苷、朝霍定A、朝霍定B和朝霍定C可被蜗牛酶依次水解为宝藿苷Ⅰ或淫羊藿苷元、箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，淫羊藿苷可被纤维素酶转化为宝藿苷Ⅰ[10-13]。上述方法可用于制备淫羊藿低糖苷类化合物，但存在酶不能重复利用的问题，导致生产成本较高，故并不适用于工业化生产。为了进一步改善上述问题，彭静等[14]以海藻酸钡为载体，通过交联-包埋法对蜗牛酶进行固定，以朝藿定A、朝藿定B、朝霍定C和淫羊藿苷为底物进行水解，水解转化率可达75.52%;经5 次重复使用后，固定化蜗牛酶的活性还可保持在原来的50%，表明该工艺在通过酶水解制得低糖苷类化合物的同时，实现了对酶的重复利用，但存在载体机械强度低、在高温和酸性条件下长时间搅拌容易吸水溶胀甚至破裂等不足。Liu 等[15]改善了酶的固定化方法，以二氧化硅为载体固定蜗牛酶，在水解淫羊藿苷和总黄酮时，酶重复利用6 次后，仍保持了60%的酶活力，其pH和热稳定性、底物浓度及酶稳定性均得到了较好的提升;同时该研究还发现，淫羊藿总黄酮的水解产物具有明显的抗肿瘤作用。

蜗牛酶中含有大量的纤维素酶，而纤维素酶的主要成分为β-葡萄糖苷酶，后者能够水解β-葡萄糖苷键，通过除去β-葡萄糖基来获得剩余黄酮母核[16]。因此，β-葡萄糖苷酶很可能是纤维素酶和蜗牛酶水解淫羊藿黄酮苷C7 位葡萄糖基的主要作用酶。研究表明，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶均可将淫羊藿苷水解为宝藿苷Ⅰ，但低浓度纤维素酶的专一性较差，容易生成副产物;而β-葡萄糖苷酶的水解率和定向转化率均接近100%，具有较高的效率和较强的专一性。这基本证明了β-葡萄糖苷酶是水解淫羊藿黄酮苷C7 位葡萄糖基的主要作用酶[17-20]。刘聪燕等[21]以壳聚糖交联介孔纳米二氧化硅为载体进行β-葡萄糖苷酶的固定，并将该酶重复用于淫羊藿苷的高效水解以制备宝藿苷Ⅰ，该研究也同样证实了β-葡萄糖苷酶对淫羊藿黄酮苷C7 位葡萄糖基的高选择性和水解的高效性。淫羊藿多糖苷类化合物在被β-葡萄糖苷酶水解的过程中会脱去C7 位上的葡萄糖基，故在水解完成后会生成低糖苷类化合物和葡萄糖。为了进一步获得纯度较高的低糖苷类化合物，避免后续烦琐的分离纯化操作，提高反应效率及节约成本，汪燕等[22]和Shen等[23-25]构建了清洁、高效的新型双相酶水解体系，该体系集水解、分离纯化为一体，基于脂溶性有机溶剂与缓冲液互不相溶且产物更易溶于有机溶剂的特点，以乙酸乙酯为有机相，以β-葡萄糖苷酶、底物和缓冲液等为水相，在短时间内将高浓度的黄酮苷类化合物淫羊藿苷、朝藿定A和朝藿定B分别水解为相应产物（转化率均在98%以上，有机相转移率超过95%），反应结束后将有机层浓缩干燥，即可获得高纯度的低糖苷类化合物，同时缓冲液中的酶可被多次重复利用。该工艺在简化操作步驟的同时，提高了反应效率，避免了后续烦琐的分离纯化过程;同时，该工艺对设备要求低，比较适合于大规模的工业化生产。

α-L-鼠李糖苷酶可特异性地作用于α-1，2、α-1，3、α-1，4、α-1，6 糖苷键，通过除去α-L-鼠李糖基来获得新的糖苷类化合物[26]。研究表明，在最优酶水解条件下，朝藿定C可被α-L-鼠李糖苷酶特异性水解脱去C3 位上的鼠李糖基转化为淫羊藿苷，但只有在底物浓度为100～200 μg/mL 的条件下才能实现完全水解[27-28]。Lyu 等[29]研究发现，在大肠埃希菌中表达的重组α-L-鼠李糖苷酶可使朝藿定C高效转化为淫羊藿苷，在最优水解条件下底物浓度有所提高但也只能达到1 mg/mL，且酶不能重复利用。该研究也同样证实了α-L-鼠李糖苷酶对淫羊藿黄酮苷C3 位鼠李糖基的高选择性。由此可见，α-L-鼠李糖苷酶主要作用于淫羊藿黄酮苷类化合物C3 位上的鼠李糖基，将朝藿定C水解为淫羊藿苷。目前，该工艺仍处于实验室研究阶段，通过该酶水解淫羊藿多糖苷类化合物来制备低糖苷类化合物，还需进一步通过酶工程等技术构建高效的水解体系，解决水解效率低和酶重复利用性差等问题。

综上，淫羊藿苷和朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C可分别被不同的酶水解为宝藿苷Ⅰ或苷元、箭藿苷A、箭藿苷B和淫羊藿苷或鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，其水解途径及产物见图1。

2 微生物转化法制备淫羊藿低糖苷类化合物

微生物细胞中存在的酶种类较多，且具有较好的糖苷类化合物转化潜力[30]。经发酵转化后脱去的糖可作为微生物生长繁殖所需的碳源，从而代谢生成更多的酶，因此微生物发酵法也被广泛应用于多糖苷类化合物的结构修饰领域[31]。

研究表明，短刺小克银汉霉菌Cunninghamellablakesleana、平菇Pleurotus ostreatus、链球菌Streptococcussp. MRG-ICA-B、肠球菌Enterococcus sp. MRG-ICA-E、布劳特氏菌Blautia sp. MRG-PMF-1 及大鼠肠道菌群均可将淫羊藿黄酮苷类化合物母核C7 位上的葡萄糖基水解代谢，生成含有鼠李糖基的次级苷类化合物，如短刺小克银汉霉菌可将朝藿定A、朝藿定B、朝霍定C、淫羊藿苷及淫羊藿苷A依次代谢为箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ及宝藿苷Ⅱ，其中大鼠肠道菌群不仅可将淫羊藿苷水解为宝藿苷Ⅰ，而且可把具有与宝藿苷Ⅰ相同母核结构的化合物转化为宝藿苷Ⅰ;平菇发酵液可将淫羊藿苷A代谢生成宝藿苷Ⅱ;淫羊藿苷与链球菌、肠球菌孵育后仅生成了宝藿苷Ⅰ，提示上述两种菌对淫羊藿黄酮苷类化合物母核C7 位上的葡萄糖基具有较好的区域选择性[32 - 35]。Cheng 等[36]和杨宇等[37]分别对绿色木霉Trichoderma viride 和柱孢梨头霉菌Absidia sp. E9r 的菌株进行发酵培养，发现两者均可分离纯化出一种酶，将淫羊藿苷水解为宝霍苷Ⅰ，在随后进行的鉴定中将这种酶鉴定为β-葡萄糖苷酶。常景玲等[38]研究发现，淫羊藿自生菌发酵液经超声处理后，可促进细胞内有效酶的释放，提高淫羊藿苷的生物转化效率。这一方面体现出微生物在天然多糖苷类化合物结构修饰方面的能力，另一方面也证明了酶是微生物进行代谢转化的关键组分。淫羊藿黄酮苷类化合物微生物转化途径及产物见图2。

3 植物细胞转化法制备淫羊藿低糖苷类化合物

与微生物转化不同的是，植物细胞中通常存在多种微生物体内不具备的特异酶，可催化某些反应而生成多种复杂或新型的化合物[39]。因此，植物细胞中的酶对黄酮苷类药物的开发具有极大的潜力。Feng 等[40]从淫羊藿属植物E. pseudowushanense B. L.中分离纯化出一种具有高选择性的鼠李糖基转移酶（EpPf3rt），以淫羊藿苷元为基础区域，特异性催化其母核C3 位上的鼠李糖基发生糖基化反应，生物合成出宝霍苷Ⅰ和宝藿苷Ⅱ。Zhang 等[41]通过培养甘草和白桑的细胞悬浮液，以淫羊藿苷为底物进行生物转化研究，通过光谱分析确定结构，生物合成出两种新的代谢物icaruralins A、icaruralinsB（手性异构体），以及已知的代谢产物宝藿苷Ⅰ（图3），表明白桑和甘草的细胞悬浮液可选择性地水解淫羊藿黄酮苷类化合物C7 位上的葡萄糖基。

4 其他

研究表明，盐酸和硫酸可脱去淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮母核上的糖基，且水解率较高，但反应不易控制，易产生淫羊藿苷元等产物[42-43]。此外，刘接卿等[44]和牟关敏等[45]分别以三羥基苯乙酮和间苯三酚为原料，经过12步反应或9 步反应实现了淫羊藿苷元的合成，但合成路线均较为烦琐且收率较低。孟坤等[46]以山柰酚-4-氧甲醚为原料，经过4 步反应合成出纯度超过98%的淫羊藿苷元，收率为30%。总的来说，酸水解法多通过水解黄酮苷类化合物C3 位和C7 位的糖基来制备淫羊藿苷元;而合成法则是以组成其母核结构的化合物为原料，通过逐步合成来实现淫羊藿苷元的制备。

5 结语

随着淫羊藿低糖苷类化合物药理作用研究的不断深入和新药研发的不断进展，其市场需求将会越来越大[47]。目前，淫羊藿低糖苷类化合物的制备多以酶水解法和微生物转化法为主，两者均是通过相关酶来脱去多糖苷类化合物上的糖基，从而转化生成低糖苷类化合物。

酶水解法具有反应条件温和、专一性强、污染少等优点，是淫羊藿低糖苷类化合物制备的重要途径，被广泛应用于天然产物的结构改造和修饰领域[48-49]。该法常用的酶包括蜗牛酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶，可通过特异性脱去母核C7、C3 位上的葡萄糖基或鼠李糖基来生成新的糖苷类化合物。由于蜗牛酶和纤维素酶的关键组分均为β-葡萄糖苷酶，而后者的主要作用位点为淫羊藿黄酮苷类化合物C7 位上的β-葡萄糖基，故其水解产物主要为含有鼠李糖基的淫羊藿次级苷和宝藿苷等;α-L-鼠李糖苷酶的主要作用位点为淫羊藿黄酮苷类化合物C3 位上的鼠李糖基，故其水解产物多为含有葡萄糖苷的淫羊藿苷等。

淫羊藿黄酮苷类化合物的生物转化主要通过切除黄酮苷类化合物上的糖基来获得低糖苷类化合物，从而为相关原料药的生产提供支持。酶水解法中，α-L-鼠李糖苷酶的水解工艺仍处于实验室研究阶段;微生物转化法和植物细胞转化法制备淫羊藿低糖苷类化合物转化体系的稳定性和产物的高效转化与分离是工业化应用的前提，相关工艺尚缺乏工业化放大生产的可行性研究;酸水解法和合成法制备中存在副产物多、收率低和环境污染等问题，且产物主要以淫羊藿苷元为主。因此，后续研究应围绕酶水解法和微生物转化法等的放大生产工艺展开，进一步解决和完善工业化生产过程中所伴随的问题，从而实现科研成果真正产业化。