盐度对水稻土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

廖洁深 何杰珩 刘广超 马驿 丁月霞 周鸿凯

摘要 [目的]研究盐浓度对水稻土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响。[方法]在不同盐浓度的土壤区域采集样品，提取土壤总DNA，采用末端限制性片段长度多样性分析技术（T-RFLP）对土壤固氮微生物nifH基因进行多样性分析。[结果]随着水稻土壤盐度上升，土壤有机质、全氮和碱解氮含量也呈现一定程度的上升趋势;水稻土壤nifH基因的分类操作单元（OTU）总数在土壤盐度最高时达最大值，各组优势细菌数量在2.5种左右，样本丰度主要集中在4个片段内，各组相对丰度差异不显著（P>0.05）;水稻组土壤与富贵竹土壤相比，多样性和均匀度均差异显著（P<0.05），水稻各组间微生物多样性呈现盐度依赖效应，但差异不显著（P>0.05）。[结论]土壤盐度影响土壤性质及固氮微生物，微生物多样性呈现一定盐度依赖效应。

关键词 固氮微生物;盐度;水稻土壤;nifH基因;多样性

中图分类号 S154.3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）12-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Salt Concentration on nifH Gene Diversity of Nitrogen-fixing Microorganisms in Rice Soil

LIAO Jie-shen， HE Jie-heng， LIU Guang-chao et al

（College of Coastal Agricultural Sciences， Guangdong Ocean University， Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective] To study the effect of salt concentration on the nifH gene diversity of nitrogen-fixing microorganisms in rice soil.[Method]Soil samples were collected from different salt concentrations parts and extracted soil total DNA to investigate effects of salt concentration on nifH gene diversity of rice soil nitrogen-fixing microorganisms by using the terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP） methods.[Result]The content of organic matter， total nitrogen and alkali-hydrolyzable nitrogen also showed a certain upward trend with the increase of soil salinity.The total number of operational taxonomic units （OTUs） of nifH gene in rice soil reached the maximum value at the highest soil salinity， the number of dominant bacteria was about 2.5 in each group， and the sample abundance was mainly concentrated in 4 fragments.There was no significant difference in relative abundance among the groups （P>0.05）The diversity and evenness of rice soil were significantly different from those of Fugui Bamboo， there was a salinity-dependent effect on microbial diversity among rice groups， but the differences were not significant（P>0.05）. [Conclusion]Soil salinity affected properties and nitrogen-fixing microorganisms， and microbial diversity showed a salinity-dependent effect.

Key words Nitrogen-fixing microorganisms;Salinity;Rice soil;nifH gene;Diversity

近年來，由于我国对海水稻方面的研究越来越深入，盐度对土壤微生物的影响成为研究的热门课题。土壤的营养价值体现在很多方面，在农业系统中，氮元素显得尤其重要，因为氮元素通常是作物生长的限制养分，也使大气氮还原为生物可用铵成为氮输入的重要来源[1]。已有研究证明，固氮微生物的丰度和群落结构与土壤有机质有一定的相关性[2]。也有研究表明，盐度对土壤微生物的多样性有一定的影响[3]，但盐度对水稻土壤的nifH基因多样性影响的研究相对较少。由于固氮微生物驱动的固氮作用是土壤有效氮的重要来源之一[4-5]，可以通过研究固氮微生物的丰度和群落结构，进一步研究土壤有机质的变化与盐度的关系。nifH基因是固氮微生物固氮酶重要的结构基因，常被用来作为检测固氮菌的一个分子指标[6]。有研究表明，nifH基因是nif操纵子研究最深入的基因，从多个环境中分离出的培养和未培养的微生物中获得了广泛的序列[7]。该试验通过检测不同盐度区域中水稻土壤的nifH基因多样性，探讨盐度对土壤固氮微生物固氮能力的影响，以期为海水稻种植提供试验依据。83F82672-524C-4726-961C-C7B8E1E62CB2

1 材料与方法

1.1 土壤采集与处理

土壤采于湛江市遂溪县建新镇卜巢村海水稻种植基地（110°07′E，21°08′N），在盐度不同的5个区域采集样本，采样深度为10～20 cm，阴干后剔除植物根茎等杂物，研磨过4 mm筛后检测土壤理化性质。

1.2 nifH基因扩增

使用OMEGA试剂盒提取土壤样品总DNA，-20 ℃保存。土壤总DNA采用PCR技术对目的基因进行扩增。nifH-F：5′-AAAGG（C/T）GG（A/T）ATCGG（C/T）AA（A/G）TCCACCAC -3′（5′端羧基荧光素标记）;nifH-R：5′-TTGTT（G/C）G C（A/G）TACAT（G/C）GCCAT-CAT-3′[8]。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（36个循环），72 ℃终延伸10 min后4 ℃保存。PCR产物采用1%凝胶电泳，110 V，30 min。

1.3 PCR产物限制性酶切以及毛细管电泳扫描

nifH基因扩增的PCR产物进行限制性酶切。反应体系为PCR产物30 μL、Hae Ⅲ  2 μL、10×Buffer 2 μL、ddH2O 6 μL。反应条件为37 ℃，4 h。将30 μL酶切产物送到上海生工技术有限公司进行毛细管电泳扫描。

1.4 数据分析与统计

数据处理采用GeneMarker软件分析电泳结果，除去相对荧光单位小于100的峰，并选取各组5个重复中都出现的峰进行统计[9]。可以认为每一个限制性片段是一个分延伸类操作单元，对应的峰面积的大小反映每一限制性片段的相对数量[10]。使用Bio-Dap软件对酶切图谱进行多样性指数分析，采用SPSS 6.12软件进行多样性指数的方差分析。

2 结果与分析

2.1 土壤的理化性质

从不同区域土壤的理化性质（表1）可以看出，除Ⅴ样地种植植物为富贵竹外，其余水稻土壤呈现盐度由高到低顺序，最高达1 394.0 μS/cm。随着盐度的逐渐上升，土壤中全氮、碱解氮和有机质含量均出现了一定程度的上升趋势，但Ⅱ组土壤有机质、全氮和碱解氮含量并没有呈现这种随盐度上升的趋势。其中，Ⅰ组土壤盐度高于其他区域，其有机质、全氮和碱解氮含量均极显著增加（P<0.01）。速效磷的含量则随着盐度的逐渐上升而出现了一定程度的下降，Ⅲ组样本速效磷的含量与其他4个样本相比极显著减少（P<001）。速效钾的含量在水稻组土壤无显著变化，与富贵竹土壤差异极显著。

2.2 nifH基因电泳图谱分析

固氮功能基因nifH的PCR扩增片段大小约为490 bp（图1）。nifH基因酶切产物的毛细电泳扫描图谱（部分）如图2所示。

2.3 固氮功能基因电泳图谱分析

2.3.1 nifH基因T-RFLP图谱OTU个数和片段丰度。

使用Gememarker软件分析毛细管电泳结果，每个限制性片段可以被认为是一个分类操作单元（operational taxonomic units，OTU），对应的峰面积反映该片段的相对数量[11]。计算OTU相对丰度时舍去小于50 pb的片段，并且OTU相对丰度小于1%的小片段也舍去，定义OTU相对丰度>4%为优势菌群，OTU≤4%为非优势菌种[8]。不同盐浓度的OTU数量与优势菌种数见表2。

根据表2可以分析Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ区域土壤平均总OTU数量相差不大，Ⅰ 样本的平均总OTU数量较高（17.20个），Ⅰ 组样本的优势菌种数量（5.60种）相对其他组较多，差异显著（P<005）。水稻土壤nifH基因的OTU總数在土壤盐度最高（样本Ⅰ）时达最大值，各组优势细菌数量在2.5种左右。各组的优势菌种的相对丰度如图3所示，基因片段大小主要集中在52、123、127、268 bp。

2.4 nifH基因多样性指数分析

一般情况下，Shannon指数和Simpson指数反映土壤微生物的多样性，Simpson指数和Shannon指数越大，表明土壤微生物群落多样性越高。由表4可知，Shannon指数第Ⅴ组相较于其他组差异极显著（P<001），Simpson指数第Ⅴ组较其他组差异极显著（P<0.01）;Pielou指数反映样本均匀度，第Ⅴ组较其他组差异极显著（P<0.01）;Brillouin指数反映物种数目，Brillouin指数第Ⅱ组与第Ⅴ组差异极显著（P<0.01），其他各组之间差异不显著。Shannon指数和Simpson指数种植富贵竹土壤与种植水稻土壤差异极显著（P<0.01）。在所有的水稻土壤中，海红11号水稻Brillouin指数有所降低，但与其他水稻土壤差异不显著（P<0.05）。综合以上数值分析，种植富贵竹的土壤微生物多样性较低，种植水稻土壤的微生物多样性随土壤盐度上升而增多，但各组间差异不显著（P>0.05）。

3 讨论与结论

通过该试验可以发现水稻土壤盐浓度对固氮功能基因nifH丰度有显著的影响，影响固氮功能基因nifH丰度的因素还包括土壤酸碱度、氮氧含量、其他微生物的相互影响作用等[12]。 因此该研究不仅设置了不同品种水稻土壤之间的比较，也设置了对富贵竹土壤固氮微生物丰度的对照。但是根据最近的一项分析发现，盐度对土壤微生物组成的影响远大于其他土壤理化性质、极端天气的影响[13]。该研究表明，富贵竹的土壤相对于其他土壤样品土壤微生物多样性较低，而其他土壤样品微生物多样性差异不大，则可以排除其他微生物对此次水稻土壤样品的影响。水稻土壤处于200 μS/cm左右盐度（样本Ⅱ～Ⅳ）时，微生物种群种类数量大致相同;土壤盐度为1 394.0 μS/cm（样本Ⅰ）时，微生物种类数量是最多的，土壤中碱解氮、全氮和有机质的含量均最高。一般认为微生物种类越多，各物种的数量越多，则功能基因的拷贝数越多[14]。水稻土壤nifH基因的OTU总数在土壤盐度最高（样本Ⅰ）时达最大值，各组优势细菌数量在2.5种左右。nifH基因的相对丰度比绝对数量更具说服力[15]。这说明当土壤处于样本Ⅰ的盐度时，应该拥有较高的nifH基因拷贝数，根据定量分析的结果判定结果符合以上推论[16]。研究发现，当土壤盐度越高时，nifH基因的丰度越高，土壤中的碱解氮、全氮和有机质含量也越高。表明当土壤处于此盐浓度时营养状况更好[17]，固氮微生物的固氮功能也更加活跃。根据nifH基因多样性指数的分析与这一论点相吻合。83F82672-524C-4726-961C-C7B8E1E62CB2

综合以上分析，该研究支持土壤固氮细菌的nifH基因丰度高的理由可能有两方面：一是盐度，样本Ⅰ（长毛谷水稻）的盐浓度明显高于其他4个样品。不论是从固氮微生物的生物多样性和群落结构来说，还是nifH基因的相对丰度来说，样本Ⅰ（长毛谷水稻）土壤的nifH基因多样性是最高的;二是pH，从对样本Ⅳ（其他品种水稻）的土壤理化性质分析，可以得知除了盐度对nifH基因具有决定性的影响外，pH对土壤中的固氮微生物也存在影响，这说明大部分的土壤固氮细菌活性受土壤pH的影响较大，土壤固氮微生物都有其生存的最适pH范围[17-18]。随着盐度的逐渐上升，全氮、碱解氮和有机质含量出现了一定程度的上升趋势。样本Ⅱ（长毛谷水稻）土壤有机质、全氮和碱解氮含量没有随着盐度的上升而变化的原因可能是受到了pH的干扰。这也在一定程度上说明了pH对nifH基因丰度有一定的影响。不同盐度条件的土壤固氮微生物的区系组成，是被土壤各种理化性质的共同作用所影响，并非仅受到单一条件影响的[19]。

一般认为，盐渍化土壤中微生物会因为受到盐的胁迫导致多样性下降[20-21]。陈瑞蕊等[22]研究显示，土壤盐分对细菌群落丰富度和多样性均没有显著影响，且高盐土壤在不同分类水平上的细菌种类与非盐和轻盐土壤相比没有降低。Walsh 等[23]研究也报道了类似的结果。在意大利滨海的高盐土壤中，细菌多样性高于正常土壤[24]。在我国河西走廊地区也发现盐碱土壤的细菌非常丰富，存在大量的细菌类群，尤其是在次生盐碱土壤中，且次生盐碱土与农田土微生物群落差异较小[25]。该试验中，水稻组土壤与富贵竹土壤相比，多样性和均匀度均差异显著（P<0.05）;水稻土壤盐度越高，水稻土壤nifH基因的丰度越高。水稻各组间微生物多样性呈现盐度依赖效应，但差异不显著（P>0.05）。土壤盐度影响土壤性质及固氮微生物，微生物多样性呈现一定盐度依赖效应。但固氮微生物在什么盐浓度中的存活率最高暂时还没结果，目前仅发现微生物生物量在中盐时最高[26]，也有研究表明，高盐会降低微生物的生物活性，微生物的群落结构会遭到一定程度的破坏[27]。nifH基因的多样性是在土壤多大盐度中呈现最佳仍需要进一步研究。

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