畜肉中匹莫林的测定

勇艳华

摘 要：本文建立了检测畜肉中匹莫林的液相色谱-串联质谱法。采用乙腈提取，正己烷脱脂，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。考察了方法的定量限、标准曲线线性、方法精密度等。结果表明，匹莫林浓度在1～200 μg/L线性良好，相关系数r=0.999 6，定量限为2.0 μg/kg，3个加标水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg、10.0 μg/kg，平均回收率为70.8%～85.3%，相对标准偏差为3.0%～5.4%。本方法具有前处理简单、精密度高、定量限低等优点，能够满足畜肉中匹莫林的测定。

关键词：畜肉;匹莫林;液相色谱-串联质谱

Determination of Pimorin in Animal Meat

YONG Yanhua

（Dalian Center for Certification and Food and Drug Control， Dalian 116630， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of pimorin in meat was established. It is extracted by acetonitrile， degreased by n-hexane， determinated by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， external standard method. The quantitative limit， linearity of standard curve and precision of the method were investigated. The results showed that the concentration of pimolin ranged from 1 to 200 μg/L has good linearity， the correlation coefficient is r=0.999 6， and the limit of quantitation is 2.0 μg/kg， 3 spiked levels were 2.0 μg/kg， 4.0 μg/kg， 10.0 μg/kg， the average recovery was 70.8%～85.3%， and the relative standard deviation was 3.0%～5.4%. The method has the advantages of simple pretreatment， high precision and low limit of quantitation， and can be used for the determination of pimolin in animal meat.

Keywords： animal meat; pimorelin; liquid chromatography-tandem mass spectrometry

匹莫林化学名称为2-亚氨基-5-苯基-4-恶唑烷酮，是一种中枢神经兴奋药物。通过提高中枢去甲肾上腺素的含量达到中枢兴奋的作用，其兴奋作用为咖啡因的5倍。虽然农业部176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中禁止匹莫林在饲料和动物饮用水中使用，但仍有饲养者在牲畜饲养过程中违法使用匹莫林，导致匹莫林在畜肉中殘留，对人体健康产生危害。匹莫林的不良反应主要包括对肝功能有损害，从肝酶无症状可逆性升高至肝炎、黄疸、肝功能衰竭;可引发再生障碍性贫血;对中枢神经系统有损伤;刺激胃肠道，导致恶心、胃痛;长时间使用可抑制人体生长[1]。因此，建立一种准确快速检测畜肉中匹莫林残留的分析方法迫在眉睫，不仅可以打击违法使用匹莫林的行为，还可为保护消费者健康提供技术支撑。

目前，报道的兴奋剂相关检测方法有胶体金试纸条法[2]、酶联免疫法[3-5]、化学发光免疫分析[6]、表面增强拉曼光谱法[7]、毛细管电泳法[8]、高效液相色谱法[9-11]、液相色谱串联质谱法[12-14]、气相色谱法[15]、气质法[16-17]和高分辨质谱法[18-19]，液相色谱串联质谱法是最常用的方法。文献中检测匹莫林的基质为尿液和饲料，但畜肉中匹莫林的检测暂无报道。本文采用乙腈提取，液相色谱串联质谱仪进行检测，建立了畜肉中匹莫林的测定方法。该方法前处理简单，精密度高，定量限低，能满足畜肉中匹莫林的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准物质匹莫林（Pemoline），CAS登录号2152-34-3，中国食品药品检定研究院生产的对照品;甲醇、乙腈、正己烷和甲酸，均为色谱纯;氯化钠，分析纯;实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱-串联质谱仪（1290/Agilent 6495，美国Agilent公司）;均质机（IKA）;涡旋混合器（IKA）;超声波清洗器（科导）;CR21N立式大容量高速离心机（日本Hiachi公司）;氮吹仪（安谱）赛多利斯全自动超纯水机（德国Sartorius公司）;Agilent poroshell 120 EC-C18色谱柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm，美国Agilent公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

称取2.5 g（精确到0.01 g）混合均匀的样品于50 mL离心管中，加入2 mL水，均质1 min，加入5 mL乙腈，涡旋混匀1 min，超声提取20 min，加入2 mL正己烷，加入1 g NaCl，涡旋混匀1 min，12 000 r/min离心5 min，移取2 mL上层提取液氮吹至近干，准确加入1 mL体积分数为10%乙腈溶解，涡旋混匀1 min，过0.22 μm滤膜，待液相色谱串联质谱仪检测。

1.3.2 标准溶液的配制

称取匹莫林对照品约10 mg（精确至0.1 mg）于小烧杯中，用甲醇溶解并转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，得到浓度为0.1 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃冷冻保存。准确移取标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为1.0 μg/mL的标准工作溶液，于4 ℃冷藏保存。准确移取10 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL和2 000 μL标准工作溶液，分别置于10 mL容量瓶中，10%乙腈定容至刻度，得到浓度为1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L匹莫林系列标准上机溶液。

1.3.3 添加回收实验

以不含匹莫林的空白畜肉为基质，添加适量浓度为1.0 μg/mL的标准工作溶液，涡旋混匀1 min，静置1 h，按1.3.1样品前处理方法进行实验。

1.3.4 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Agilent poroshell 120 EC-C18（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）;柱温：35 ℃;流动相：A为0.1%甲酸水（体积分数），B为0.1%甲酸乙腈（体积分数）;梯度洗脱程序：0～1.0 min，90%A，1.0～4.0 min，90%～0%A;4.0～5.0 min，0%A;5.1～7.0 min，90%A。流速：0.3 mL/min;进样体积：2 μL。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：正离子扫描;毛细管电压：4 000 V;监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）;离子源温度：200 ℃;去溶剂气温度：250 ℃;去溶剂气：氮气12 L/min;锥孔气：氮气11 L/min。其他参数详见表1。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的选择

匹莫林难溶于水、乙醚、氯仿、丙酮、苯和稀盐酸，溶于无水乙醇、丙二醇、甲醇和丙酮，易溶于碱性溶液。本实验考察甲醇和乙腈提取效果，由于畜肉中含有大量蛋白质和脂肪，用甲醇提取还需进一步用固相萃取小柱净化，前处理相对烦琐;但乙腈对蛋白有沉淀作用，用乙腈作为提取试剂，正己烷除脂肪，前处理步骤简单，除蛋白和脂肪效果较好，因此选择乙腈作为提取试剂。

2.2 仪器条件的建立

匹莫林的结构决定了可以在反相色谱上获得分离，故采用C18色谱柱进行分离，流动相乙腈-水-甲酸混合梯度洗脱。优化了质谱检测中碰撞能量、脱溶剂气流速和温度、锥孔气流速等参数，确定灵敏度最高、稳定性和重现性最好的选择性提取离子作为定量离子，次之的作为定性离子。

2.3 线性范围及检出限

匹莫林标准工作溶液在1～200 μg/L浓度与峰面积呈线性相关。匹莫林线性方程为Y=5 594.264 692X-

5 371.773 294，相关系数r=0.999 6。以猪肉、牛肉、羊肉为基质，定量向其中添加匹莫林标准溶液，按1.3.1样品前处理方法提取测定后，质谱峰信噪比≥10

时的添加量确定为本方法的定量限，定量限为2.0 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

以不含匹莫林的猪肉、牛肉、羊肉为空白基质，将标准工作溶液按2.0 μg/kg、4.0 μg /kg和10.0 μg /kg

3个添加浓度加入空白基质中，考察平均回收率

及6次平行实验相对标准偏差（RSD），结果如表2所示。平均回收率为70.8%～85.3%，RSD≤5.4%。对猪、牛、羊肉按照本方法进行测试，未发现有本底干扰。

3 结论

本文建立了检测畜肉中匹莫林残留的高效液相色谱-串联质谱方法，匹莫林浓度在1～200 μg/L线性良好，相关系数r=0.999 6，定量限为2.0 μg/kg，3个加标水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg、10.0 μg/kg，平均回收率为70.8%～85.3%，相对标准偏差为3.0%～5.4%，此方法快速、高效、准确且便于操作，可用于畜肉中匹莫林残留的日常检测。

参考文献：

[1]王丹，杨悦，宋秋洁.匹莫林致肝损害情况分析及上市后监管[J].中国药物警戒，2006，3（1）：36-39.

[2]李莎，白瑞樱，曾道平，等.胶体金免疫层析试纸条在猪尿β-兴奋剂多残留检测中的应用[J].食品工业科技，2016，37（20）：53-58.

[3]万宇平，刘宇，陶光灿，等.动物组织中β-兴奋剂类药物多残留酶联免疫检测方法的建立[J].河南农业科学，2013，42（2）：132-135.

[4]孙作刚，赵晓凤.用酶联免疫吸附法测定畜产品、饲料中β-兴奋剂类药物[J].草食家畜，2017（6）：31-37.

[5]王向阳，同学政，王文珺.酶联免疫分析法在奥运食品安全检测中的应用[J].科技导报，2008，26（15）：47-49.

[6]朱宝，奚惠芳.Access全自动微粒子化学发光免疫分析系统检测运动员兴奋剂122例报道[J].临床研究，2008，24（9）：941.

[7]翟福丽，黄轶群，王锡昌，等.应用表面增强拉曼光谱技术快速检测尿样中的β-兴奋剂[J].分析化学，2012，40（5）：718-723.

[8]方怀防，曾昭睿.高效毛细管电泳在兴奋剂检测中的应用进展[J].分析化学，2005，33（6）：881-886.

[9]中华人民共和国农业部.农业部2086号公告-3-2014饲料中匹莫林的测定 高效液相色谱法[S].北京：中国农业出版社，2014.

[10]金晓，周志华，何秀峰，等.尿液中利尿剂、丙磺舒、咖啡应、匹莫林的固相提取和HPLC初筛分析[J].药学学报，1992，27（11）：857-880.

[11]安洪泽，张素霞，沈建忠，等.高效液相色谱-紫外串联荧光检测法测定猪饲料中五种β-兴奋剂[J].饲料工业，2008，29（6）：54-56.

[12]申利.高效液相色谱-串联质谱法同时筛查人尿中40种世界反兴奋剂机构禁用药物[J].体育科学，2015，35（5）：66-70.

[13]班付国，方忠意，刘素梅，等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法对饲料中匹莫林的测定[J].分析测试学报，2009，28（6）：705-708.

[14]刘学芝，赵英莲，马跃，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉、鸡蛋、牛奶中9种食源性兴奋剂类药物残留[J].色谱，2022，37（2）：148-155.

[15]邱丽君，郑小严，游飞明，等.气相色谱-氮磷检测方法同时检测尿样中的刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类五种兴奋剂[J].色谱，2009，27（3）：364-367.

[16]刘五一，张旭，方建军，等.气质法快速测定畜禽肉中4种β-兴奋剂的前处理新技术研究[J].检测分析，2016，37（6）：154-157.

[17]景晶，王杉，刘欣，等.气相串接质谱联用法确证人尿中44种外源性蛋白同化类激素[J].中国运动医学杂志，2020，39（6）：476-481.

[18]刘赟玺，董天宇，张玉峰，等.通过超高效液相色谱 -四极杆-靜电场轨道阱高分辨质谱联用仪对人尿中42种小肽类禁用物质进行兴奋剂检测[J].中国运动医学杂志，2021，40（8）：638-647.

[19]刘欣，徐友宣，张亦农，等.GC/HRMS在兴奋剂检测中的应用研究[J].质谱学报，2001，22（3）：66-70.