舒肝解郁胶囊通过激活JAK1／STAT3信号通路改善大鼠抑郁症及修复海马神经元细胞

白天山，李志榕，黄 平，徐 烨，柳文华

1.开封市第五人民医院医教科，开封 475000；2.开封市第五人民医院精神科一病区，开封 475000；3.商丘市第二人民医院精神科三病区，商丘 476000；4.河南大学淮河医院科研与研究生工作部，开封 475000

抑郁症的具体发病机制尚未明确，神经元和神经的可塑性假说是目前公认的主要病理机制之一［1］。研究证实［2］，抑郁症患者存在海马体积缩小和神经元缺失的情况。因此，抑制神经元细胞凋亡已成为抑郁症的治疗目标之一。中医学将抑郁症归为“郁证”范畴，为情志不舒、肝气郁结所致，治疗应以疏肝理气解郁为主［3］。舒肝解郁胶囊是具有疏肝理气、健脾安神作用的中成药，适用于情绪低落、兴趣迟滞的单项抑郁症患者的治疗［4］。本研究通过慢性轻度不可预见性应激结合孤养建立抑郁症大鼠模型，探讨舒肝解郁胶囊对抑郁症及海马神经元细胞损伤的改善和修复作用，并探讨其机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SM2010R型徕卡切片机［徕卡显微系统（上海）贸易有限公司］；3550UV 型酶标仪、7500型实时荧光定量PCR仪均购自美国Bio-Rad公司；JP-K600型全自动化学发光成像分析系统（上海嘉鹏科技有限公司）。

1.2 试药

舒肝解郁胶囊（批号200313，四川济生堂药业有限公司）；氟西汀（批号19041128，苏州中化药品工业有限公司）；JAK 激酶抑制剂AG490（批号YT316，北京百奥莱博科技有限公司）；兔抗鼠酪氨酸蛋白激酶-1 （tyrosine-protein kinase 1，JAK1，货 号abx027832），信号转导激活转录因子-3（signal transducer activated transcription factor-3，STAT3，货号A73260-100），磷酸化（p）-JAK1（货号abx009836），p-STAT3（货号20R-2918）多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自艾美捷科技有限公司。

1.3 动物

SPF级雄 性SD 大 鼠，50 只，6 周 龄，体 质 量 为200～240 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2016-0011。

2 方法

2.1 造模及给药

所有大鼠适应性饲养1周，称体质量后随机分为对照组、模型组、舒肝解郁胶囊组、阳性药物组、舒肝解郁胶囊＋AG490组，每组10只。除对照组外，均采用慢性轻度不可预见性应激结合孤养建立抑郁症大鼠模型［5］，电击足底（电流强度1 m A，电压45 m V，10 s／次，间 隔1 min，共30 次），冰 水 游 泳（4 ℃，5 min），束 缚（8 h），摇 晃（1 次／s，15 min）、夹 尾（3 min），热应激（45℃，5 min），禁食（24 h），禁水（24 h），昼夜颠倒、倾斜鼠笼与潮湿垫料（100 g垫料中加入200 m L 水）。每天给予1种处理方式，顺序随机，连续处理21 d，单笼饲养。对照组除每天抓取1次外，正常饲养，不采取其他处理。舒肝解郁胶囊组自建模第1天开始给予舒肝解郁胶囊150 mg·kg－1（以质量浓度5 g·L－1羧甲基纤维素钠悬浮液配制）灌胃，阳性药物组以氟西汀1.54 m L·kg－1灌胃（以质量浓度为5 g·L－1的羧甲基纤维素钠悬浮液配制），舒肝解郁胶囊＋AG490 组以舒肝解郁胶囊150 m L·kg－1＋AG490 5 m L·kg－1灌胃，对照组和模型组以质量浓度为5 g·L－1的羧甲基纤维素钠12.5 mg·kg－1灌胃，每日1次，至建模结束。

2.2 大鼠行为学评价

敞箱实验于灌胃结束24 h 后进行。敞箱为80 cm×80 cm×4 cm 的无盖立柱体，周壁均为黑色，底部为白色，底部划分为16 cm×16 cm 的方格25个。将大鼠置于箱内底板中心，以穿越底板格数为水平活动得分，穿越1格记1分（4只脚均在同一格子内），若沿线行走则每行走10 cm 记1分。以大鼠直立次数为垂直活动得分（双足离开底板），直立1次记1分，每次记录10 min。水平活动反映大鼠活动度，垂直活动反映大鼠对新鲜环境的好奇程度。敞箱实验得分＝水平活动得分＋垂直活动得分。

糖水消耗实验于敞箱实验结束后进行，以10 g·kg－1蔗糖溶液和自来水供大鼠饮用，通过测量禁水2.5 h后大鼠1 h内的糖水和自来水消耗量，计算糖水消耗百分比。糖水消耗百分比＝（糖水消耗量／总液体消耗量）×100%。

2.3 海马区神经元细胞观察

糖消耗实验后用断头法处死大鼠，每组任选5只取双侧海马组织，以体积分数为4%的多聚甲醛固定24 h，组织块常规脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋，切片，厚度5μm。

Nissl染色：组织切片脱蜡、乙醇脱水及水洗后，加入缓冲亚甲蓝染液染色10 min，0.2 mol·L－1乙酸盐分色2 min，观察海马CA1区神经元存活情况，阳染为胞核淡染，胞质蓝色，细胞轮廓清晰，用ImagePro Plus 6.0软件对存活神经细胞进行计数，任选5个视野计算平均值。

Tunel染色：组织切片脱蜡水洗后加入Tunel反应混合液，于湿盒中37℃孵育60 s，用PBS冲洗，加入POD 转化剂，于湿盒中37℃孵育30 s，用PBS冲洗，加入DAB底物溶液，室温孵育3 s，用PBS冲洗，用苏木素复染，脱水，干燥，用中性树胶封片，置于光镜下观察，阳染细胞核可见棕黄色颗粒，选择具有代表性的海马CA1 区分析结果，任选5 个视野计数Tunel阳性细胞数。

2.4 海马组织JAK1、STAT 3 mRNA表达水平的检测

取出每组剩余5只大鼠的海马组织立即置于液氮中，后保存于－80℃备用。取保存于－80℃的左侧海马组织，置于液氮中研磨，用Trizol法提取总RNA，逆转录获得cDNA，用琼脂糖凝胶电泳法鉴定产物后进行实时荧光定量PCR。引物序列见表1。根据试剂盒说明书设定反应体系。反应条件：96℃预变性5 min，94℃变性20 s，58℃退火40 s，72℃延伸50 s，重复45 个循环。以β-actin 为内参基因，2－CT为目的基因的相对表达强度，所有实验重复3次取平均值。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

2.5 海马组织JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3蛋白检测

取保存于－80℃的每组右侧海马组织，用BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳分离，转移至PVDF膜，加入封闭液置于室温摇床中封闭1 h，加入用封闭液稀释的一抗（1∶500），4℃孵育过夜，用洗液洗膜3次，加入用封闭液稀释的二抗（1∶2 000），室温孵育2 h，于暗室中曝光、显影和定影。用Image J软件进行灰度值分析，以目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值的比值表示蛋白的相对表达量，并计算p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 敞箱实验得分与糖水消耗百分比比较

与对照组比较，模型组敞箱实验得分及糖水消耗百分比降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药物组敞箱实验得分、糖水消耗百分比升高（P＜0.01）；与阳性药物组比较，舒肝解郁胶囊组敞箱实验得分、糖水消耗百分比降低（P＜0.01）；与舒肝解郁胶囊组比较，舒肝解郁胶囊＋AG490组敞箱实验得分、糖水消耗百分比降低（P＜0.01）；模型组与舒肝解郁胶囊＋AG490组敞箱实验得分、糖水消耗百分比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2、图1。

图1 海马CA1区Nissl染色结果（×400）Fig.1 Results of Nissl staining in CA1 area of hippocampus（×400）

表2 敞箱实验得分、糖水消耗百分比比较（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of scores of open field test and percentage of sugar water consumption（±s，n＝10）

表2 敞箱实验得分、糖水消耗百分比比较（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of scores of open field test and percentage of sugar water consumption（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.01；与阳性药物组比较，△P＜0.05；与舒肝解郁胶囊组比较，▲P＜0.01。

项目 敞箱实验得分／分 糖水消耗百分比对照组 108.35±8.54 80.21%±5.01%模型组 22.34±4.65* 40.15%±3.36%*阳性药物组 88.32±6.53*＃ 70.71%±4.01%*＃舒肝解郁胶囊组 70.42±5.36*＃△ 62.35%±3.85%*＃△舒肝解郁胶囊＋AG490组 24.01±4.33*△▲ 41.37%±3.50%*△▲F 401.096 198.690 P＜0.001 ＜0.001

3.2 海马组织神经元细胞存活情况比较

与对照组比较，模型组神经元细胞存活数量减少（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药物组神经元细胞存活数量增加（P＜0.01）；与阳性药物组比较，舒肝解郁胶囊组神经元细胞存活数量减少（P＜0.01）；与舒肝解郁胶囊组比较，舒肝解郁胶囊＋AG490 组神经元细胞存活数量增加（P＜0.01）；模型组与舒肝解郁胶囊＋AG490组神经元细胞存活数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3、图2。

图2 海马CA1区Tunel染色结果（×400）Fig.2 Results of Tunel staining in CA1 area of hippocampus（×400）

表3 海马组织神经细胞存活数量比较（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of survival number of nerve cells（±s，n＝10）

表3 海马组织神经细胞存活数量比较（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of survival number of nerve cells（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.01；与阳性药物组比较，△P＜0.05；与舒肝解郁胶囊组比较，▲P＜0.01。

项目 神经元细胞存活数量／个对照组155.20±10.12模型组 45.40±5.85*阳性药物组 122.40±8.35*＃舒肝解郁胶囊组 102.60±7.81*＃△舒肝解郁胶囊＋AG490组 46.40±6.01*△▲F 401.096 P＜0.001

3.3 海马组织神经元细胞凋亡情况比较

与对照组比较，模型组的凋亡细胞数量增加（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药物组的凋亡细胞数量减少（P＜0.01）；与阳性药物组比较，舒肝解郁胶囊组凋亡细胞数量增加（P＜0.01）；与舒肝解郁胶囊组比较，舒肝解郁胶囊＋AG490 组凋亡细胞数量减少（P＜0.01）；模型组与舒肝解郁胶囊＋AG490组神经元细胞凋亡数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表4。

表4 神经细胞凋亡数量比较（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis of nerve cells（±s，n＝10）

表4 神经细胞凋亡数量比较（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis of nerve cells（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.01；与阳性药物组比较，△P＜0.05；与舒肝解郁胶囊组比较，▲P＜0.01。

项目 神经元凋亡存活数量／个对照组6.80±2.50模型组 116.40±4.36*阳性药物组 38.40±4.33*＃舒肝解郁胶囊组 58.60±4.20*＃△舒肝解郁胶囊＋AG490组 114.40±4.80*△▲F 401.096 P＜0.001

3.4 海马组织JAK1、STAT3 mRNA 表达水平比较

JAK1、STAT3 mRNA 的相对表达量组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表5、图3。

图3 Western blot检测海马组织JAK1、p-JAK1、STAT3及p-STAT3蛋白表达情况Fig.3 Protein expression of Jak1，p-jak1，STAT3 and p-STAT3 detected by Western blot

表5 JAK1、STAT3 mRNA相对表达量比较（±s，n＝10）Tab.5 Comparison of relative expression of JAK1 and STAT3 mRNA（±s，n＝10）

表5 JAK1、STAT3 mRNA相对表达量比较（±s，n＝10）Tab.5 Comparison of relative expression of JAK1 and STAT3 mRNA（±s，n＝10）

项目JAK1 STAT3对照组0.88±0.12 0.90±0.15模型组 0.85±0.13 0.84±0.14阳性药物组 0.84±0.12 0.86±0.12舒肝解郁胶囊组 0.86±0.10 0.88±0.13舒肝解郁胶囊＋AG490组 0.87±0.11 0.85±0.14 F 0.092 0.156 P 0.984 0.958

3.5 海 马 组 织p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3比较

与对 照 组 比 较，模 型 组p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药物组p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3升高（P＜0.01）；与阳性药物组比较，舒肝解郁胶囊组p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3降低（P＜0.01）；与舒肝解郁胶囊组比较，舒肝解郁胶囊＋AG490组p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3降低（P＜0.01）；模型组与舒肝解郁胶囊＋AG490组p-JAK1／JAK1、p-STAT 3／STAT 3比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表6。

表6 p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3比较（±s，n＝10）Tab.6 Comparison of p-JAK1／JAK1 and p-STAT3／STAT3（±s，n＝10）

表6 p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3比较（±s，n＝10）Tab.6 Comparison of p-JAK1／JAK1 and p-STAT3／STAT3（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与阳性药物组比较，△P＜0.05；与舒肝解郁胶囊组比较，▲P＜0.05。

项目 p-JAK1／JAK1 p-STAT3／STAT3对照组0.88±0.08 0.92±0.08模型组 0.22±0.04* 0.25±0.05*阳性药物组 0.61±0.06*＃ 0.71±0.06*＃舒肝解郁胶囊组 0.43±0.05*＃△ 0.54±0.05*＃△舒肝解郁胶囊＋AG490组 0.23±0.04*△▲ 0.24±0.04*△▲F 123.137 132.048 P＜0.001 ＜0.001

4 讨论

研究发现［6］，慢性应激状态可促进脑内谷氨酸的释放，导致神经元细胞损伤，海马体积缩小。海马体积缩小则影响其对下丘脑-垂体-肾上腺素轴的负反馈调节，导致激素、神经递质分泌发生改变，加重抑郁症状［7］。因此，减轻神经元损伤在抑郁症的治疗中意义重大。中医学认为肝郁是抑郁症发病的核心，同时涉及脾、肾等多个脏器，因此疏肝理气、健脾补肾是治疗的关键［8］。

舒肝解郁胶囊由贯叶金丝桃和刺五加组成，贯叶金丝桃归肝经，可疏肝解郁、清热利湿［9］。刺五加归脾、肺、心及肾经，可益气健脾、补肾安神［10］。现代药理研究结果［11-12］表明，贯叶金丝桃中的间苯三酚类化合物及刺五加中的皂苷类化合物，可促进神经递质的重吸收与神经突触的重建，有抗抑郁及抗应激作用。傅松年等［13］研究发现贯叶金丝桃提取物对抑郁模型小鼠抑郁行为有改善作用。徐向东等［14］认为，刺五加含药血清能促进海马神经元的存活。本研究结果显示，经舒肝解郁胶囊干预后抑郁症大鼠敞箱实验得分、糖水消耗百分比、神经元细胞存活数量增加，说明舒肝解郁胶囊能有效改善大鼠的抑郁行为，促进神经元细胞存活、抑制凋亡。

JAK1／STAT3信号通路是众多细胞因子信号转导的共同途径，参与神经细胞的增殖、分化、凋亡及炎症反应过程［15］。JAKs能促进STATs磷酸化，与相应的靶基因启动子结合，激活相关基因的表达和转录［16-17］。研 究 表 明［18］，在 脑 组 织 受 损 时，JAK1／STAT3信号转导通路可被激活诱导细胞的增殖、分化和凋亡。另有研究发现，JAK1／STAT3信号通路的激活能减轻β-淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元损伤［19］。钱磊等［20］的研究显示，JAK1／STAT3信号通路具有神经保护作用。在本研究中，经舒肝解郁胶囊干预 后 大 鼠p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3 升高，用JAK1／STAT3 抑制剂后，敞箱实验得分与p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3 降 低，表 明 舒 肝 解郁胶囊能改善抑郁症大鼠抑郁行为，保护海马神经元细胞，其机制与JAK1／STAT 3信号通路的激活有关。

综上所述，舒肝解郁胶囊可能通过激活JAK1／STAT3信号通路改善抑郁症大鼠的抑郁行为，促进海马神经元细胞存活、抑制凋亡。舒肝解郁胶囊中不同化学成分的药理作用不同，对抑郁症的影响机制不一，今后可进一步探讨舒肝解郁胶囊作用于抑郁症的其他机制，为抑郁症的治疗提供更多参考信息。