过表达脂肪非典型钙黏蛋白4对结直肠癌化疗耐药的影响

杨少宾，王昱良，李俊娜，王朝杰

1.黄河三门峡医院消化内科，三门峡 472000；2.河南省人民医院肿瘤内科，郑州 450003

多项研究表明［1-2］，结直肠癌病死率高的一个重要原因为化疗耐药，包括原发性、继发性2种，其中继发性耐药较常见，可导致病情反复或加重，使治疗的难度增大。脂肪非典型钙黏蛋白4（fat atypical cadherin 4，FAT4）为钙黏蛋白超家族成员之一，属于单跨膜蛋白受体，能对上游相关信号通路的细胞外信号向细胞内传导进行调控［3］。有研究发现［4-5］，FAT4属于肿瘤抑制基因，在多种肿瘤中呈低表达，可能参与正常组织向肿瘤组织转变的过程。目前，FAT4过表达对人结直肠癌细胞继发性化疗耐药性的影响及具体机制尚不明确。本文分析FAT4过表达对人结直肠癌HCT116细胞继发性化疗耐药性的影响，并探讨其作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Mx3005P型实时荧光定量分析（RT-PCR）仪（美国安捷伦科技公司）；TC2323型CO2培养箱（美国Shellab公司）；CH2-TKC-3 型倒置光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；Mod 550型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

奥沙利铂（杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司）；青霉素、链霉素均购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基（美国HyClone公司）；LipofectamineTM3000 试 剂（美 国Life Technologies 公 司）；过 表 达FAT4慢病毒核心质粒、空载体慢病毒均购自中国科学院上海生命科学研究院；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒［东仁化学科技（上海）有限公司］；FAT4、β-actin引物序列均购自日本Ta KaRa Bio株式会社；兔抗人FAT4、P53、磷酸化-p53（p-p53）、鼠双微粒体基因2（murine double minute2，MDM2）一抗及山羊抗兔IgG 二抗均购自美国Novus Biologicals公司。

1.3 细胞系

正常人类肠黏膜上皮细胞系FHC、人结直肠癌HCT116细胞均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

2 方法

2.1 细胞培养

取正常人类肠黏膜上皮细胞系FHC、人结直肠癌HCT116 细胞，分别接种于含质量浓度为50 mg·L－1胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于体积分数5%二氧化碳培养箱中培养，温度37℃，每2 d更换1次培养液，实验前培养4 d。

2.2 结直肠癌细胞与正常肠黏膜上皮细胞中FAT4 m RNA 表达水平的检测

用RT-PCR 法检测。取处于对数生长期的正常人类肠黏膜上皮细胞、人结直肠癌HCT116细胞，用Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，进行RTPCR 反 应。反 应 体 系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）12.5μL，cDNA 模 版2μL，上、下 游 引 物 各1μL，双 蒸 水8.5 μL。反 应 条 件：95 ℃预 变 性，5 min；95℃变性，5 s；60℃退火延伸，20 s，40 个 循环。引物序列见表1。进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析系统分析电泳条带，以β-actin为内参，计算FAT4 m RNA 的相对表达水平（2－△△CT）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.3 过表达人结直肠癌HCT116 细胞中的FAT4及转染

用胰酶消化、收集处于对数生长期的HCT116细胞，根据病毒包被、转染试剂要求，将过表达FAT4慢病毒核心质粒包装成病毒，按照LipofectamineTM3000 试剂说明书，用其与空载体慢病毒转染HCT116细胞，6 h。随后更换新鲜的DMEM 培养液，继续培养48 h。将人结直肠癌HCT116 细胞分为3组：以过表达FAT4 病毒转染HCT116 细胞作为实验组，以空载体病毒转染HCT116 细胞作为对照组，以无病毒转染HCT116 细胞作为空白组。转染48 h后，用倒置荧光显微镜计数细胞总数、发绿色荧光细胞数，计算转染效率。转染效率＝（发绿色荧光细胞数÷细胞总数）×100%。

2.4 转染后HCT116细胞中FAT4 mRNA 表达水平的检测

用RT-PCR 进 行 检 测。取2.3 项 下 的3 组 细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，按照2.2项下方法进行RT-PCR 反应。进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析系统分析电泳条带，以β-actin为内参，计算FAT4 m RNA 的相对表达水平（2－△△CT）。

2.5 转染后HCT116 细胞中FAT4 蛋白表达水平的检测

用Western blot检测。取2.3项下3组细胞，用PBS清洗2次，RIPA 裂解液进行冰上裂解，30 min。以4℃，12 000 r·minL－1离心10 min，半径为8 cm，取上清液。用BCA 法进行蛋白定量，沸水浴变性10 min。以质量浓度120 g·L－1的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜，用脱脂奶粉封闭1 h。加兔抗人FAT4一抗（1∶1 000），4℃，摇床孵育，过夜。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加Ig G二抗（1∶2 500），室温下孵育2 h。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加ECL 增强化学发光剂。用Image Quant LAS4000生物分子成像仪曝光成像，观察条带灰度值。目的蛋白水平＝目的蛋白条带灰度值÷β-actin条带灰度值。

2.6 FAT4 过表达对人结直肠癌HCT116 细胞化疗耐药影响的检测

用CCK-8法检测。取2.3项下3 组细胞，接种于96孔板，各组设5个复孔。待细胞贴壁后，以不同质量浓度（1.6、2.4、3.2、4.0、4.8μg·m L－1）的奥沙利铂干预各组细胞，以未处理细胞为对照孔，仅加培养液200μL。处理24 h后，各孔加CCK-8 5μL，置于体积分数5%CO2培养箱中培养4 h，箱内温度37℃。以含质量浓度为1.0 mg·L－1DMSO 的DMEM 溶液加入各孔，振荡10 min。待结晶溶解后，用酶标仪检测570 nm 处的吸光度（A），并计算药物半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）及 化疗耐药 倍 数（resistance fold，RF）。IC50＝（实验孔吸光度值÷对照孔吸光度值）×100%。RF＝耐药细胞IC50值÷亲本细胞IC50值。

2.7 FAT4 过表达对人结直肠癌HCT116 细胞凋亡率影响的检测

用流式细胞术进行检测。取2.3项下3组细胞，接种于96孔板，待细胞贴壁后，以最接近IC50值质量浓度（3.2μg·m L－1）的奥沙利铂干预各组细胞24 h。随后各孔加不含EDTA 的胰酶消化，以EP管收集各组细胞，用PBS 洗涤细胞2 次。管内加1×binding buffer 200μL重悬细胞，于细胞重悬液内加入Annexin V-PE 5 μL，混匀，室温下避光孵育10 min。以7-AAD 5μL加入各管，吹打混匀，4 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.8 免疫共沉淀实验

取2.3项下3组细胞，接种于96孔板，待细胞贴壁后，以质量浓度3.2μg·m L－1的奥沙利铂干预24 h。将细胞置于RIPA 裂解液中裂解，以12 000 r·min－1离心15 min，离心半径8 cm，转移上清至新的离心管。用PBS洗涤蛋白A／G 琼脂糖珠2次，制备成20μL 蛋白A／G 琼脂糖珠工作液。4℃，振荡10 min，去除非特异性结合蛋白干扰。以12 000 r·min－1离心15 s，离心半径为8 cm，转移上清液至新的离心管，弃蛋白A／G 琼脂糖珠，加p53 抗体或MDM2抗体（或FAT4抗体）5μL。4℃，缓慢振荡过夜。以12 000 r·min－1离心15 s，离心半径为8 cm，收集免疫沉淀产物。以经过预冷的PBS洗涤，重复3次。加上样缓冲液15μL，置于沸水浴中变性5 min，用Western blot检测FAT4、p53、p-p53及MDM2蛋白的表达水平。

2.9 p53、p-p53及MDM2蛋白相对表达量的检测

用Western blot检测。取2.3项下3组细胞，接种于96 孔板，待细胞贴壁后，以质量浓度为3.2μg·m L－1的奥沙利铂干预各组细胞24 h，开始实验。细胞裂解、蛋白定量、沸水浴变性、凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭等步骤同1.2.5。加兔抗人p53（1∶1 000）、p-p53（1∶1 000）及MDM2（1∶1 000）一抗，置于4℃摇床中孵育过夜。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加IgG 二抗（1∶2 500），室温下孵育2 h。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加ECL 增强化学发光剂，曝光成像，观察条带灰度值。目的蛋白水平＝目的蛋白条带灰度值／β-actin条带灰度值。

2.10 统计学方法

用SPSS 19.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组计量资料比较用单因素方差分析，两两样本比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 结直肠癌细胞与正常肠黏膜上皮细胞中FAT4的表达水平

人结直肠癌HCT116 细胞中FAT4 mRNA 的相对表达量为（0.36±0.12），正常人类肠黏膜上皮细胞中FAT4 m RNA 的相对表达量为（1.02±0.35），差异有统计学意义（t＝3.989，P＝0.002）。FAT4在结直肠癌HCT116细胞中呈低表达。

3.2 转染效率

经检测，对照组转染效率为89.58%，实验组转染效率为90.05%，可用于后续实验。结果见图1。

图1 LipofectamineTM 3000介导质粒转染HCT116细胞后的显微镜下照片Fig.1 Pictures of transfected HCT116 cells mediated by LipofectamineTM 3000 plasmid under microscope

3.3 HCT116细胞中FAT4 m RNA、蛋白的相对表达量

各组FAT 4 mRNA、蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组、对照组比较，实验组FAT 4 mRNA、蛋白的相对表达量升高（P＜0.05）；空白组与对照组FAT 4 mRNA、蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2、图2。

图2 Western blot检测HCT116细胞中FAT4蛋白的表达量Fig.2 Expression of FAT4 protein in HCT116 cells detected by Western blot

表2 各组FAT4 mRNA、蛋白相对表达量的比较（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group（±s，n＝5）

表2 各组FAT4 mRNA、蛋白相对表达量的比较（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group（±s，n＝5）

注：与空白组比较，a P＜0.05；与对照组比较，b P＜0.05。

项目 FAT4 mRNA FAT4蛋白空白组0.36±0.11 0.27±0.10对照组 0.34±0.13 0.26±0.11实验组 1.15±0.19ab 0.98±0.18ab F 49.178 46.908 P＜0.001 ＜0.001

3.4 过表达FAT4对HCT 细胞化疗耐药性的影响

各组细胞增殖活性均随奥沙利铂质量浓度增加而降低（P＜0.05）。各组IC50值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组、对照组比较，实验组IC50值降低（P＜0.05）；空白组与对照组IC50值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。空白组、对照组和实验组RF 分别为5.65、5.75、2.18 倍。结果见表3、表4。

表3 各组不同奥沙利铂质量浓度时A值的比较（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group（±s，n＝5）

表3 各组不同奥沙利铂质量浓度时A值的比较（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group（±s，n＝5）

奥沙利铂质量浓度／（μg·mL－1）空白组 对照组 实验组1.6 93.02±4.51 92.54±4.96 87.65±3.65 2.4 79.12±4.03 78.65±4.13 70.05±3.44 3.2 63.05±3.28 62.68±3.77 52.13±2.96 4.0 36.04±2.74 35.74±2.61 22.36±2.14 4.8 15.02±1.08 14.54±1.02 9.54±1.07 F 449.074 394.159 663.965 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 各组IC50值的比较（±s，n＝5）Tab.4 Comparison of IC50 values in each group（±s，n＝5）

表4 各组IC50值的比较（±s，n＝5）Tab.4 Comparison of IC50 values in each group（±s，n＝5）

注：与空白组比较，a P＜0.05；与对照组比较，b P＜0.05。

项目 IC50／（μg·mL－1）空白组3.52±0.05对照组 3.51±0.02实验组 3.28±0.01ab F 61.444 P 0.016

3.5 过表达FAT4对HCT 细胞凋亡的影响

各组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组、对照组比较，实验组细胞凋亡率升高（P＜0.05）；空白组与对照组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图3、表5。

图3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡Fig.3 Comparison of apoptosis detected by flow cytometry in each group

表5 各组细胞凋亡率的比较（±s，n＝5）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n＝5）

表5 各组细胞凋亡率的比较（±s，n＝5）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n＝5）

注：与空白组比较，a P＜0.05；与对照组比较，b P＜0.05。

项目 细胞凋亡率空白组4.61%±0.41%对照组 5.02%±0.43%实验组 23.62%±0.85%ab F 788.709 P＜0.001

3.6 Co-IP 实验结果及p53、p-p53、MDM2 蛋白 的相对表达量

Co-IP实验结果显示，FAT4与p-p53、MDM2均存在特异的相互作用。

Western blot结果显示，各组p-p53、MDM2 蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组p53蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组、对照组比较，实验组p-p53蛋白的相对表达量升高，MDM2蛋白的相对表达量降低（P＜0.05）；空白组与对照组p-p53、MDM2蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图4、表6。

图4 Western blot检测各组p53、p-p53、MDM2蛋白的表达水平Fig.4 Expression levels of P53，p-P53 and MDM2 proteins detected by Western blot in each group

表6 各组P53、p-P53、MDM2蛋白相对表达量的比较（±s，n＝5）Tab.6 Comparison of the relative expression of P53，p-P53 and MDM2 in each group（±s，n＝5）

表6 各组P53、p-P53、MDM2蛋白相对表达量的比较（±s，n＝5）Tab.6 Comparison of the relative expression of P53，p-P53 and MDM2 in each group（±s，n＝5）

注：与空白组比较，a P＜0.05；与对照组比较，b P＜0.05。

项目 P53 p -P53 MDM2空白组0.72±0.09 0.27±0.03 0.65±0.06对照组 0.73±0.08 0.26±0.04 0.65±0.08实验组 0.73±0.09 0.78±0.05ab 0.29±0.03ab F 0.022 265.300 59.450 P 0.978 ＜0.001 ＜0.001

4 讨论

结直肠癌为临床常见的消化系统恶性肿瘤，多数患者早期症状不典型，确诊时通常已处于中晚期，病死率高［6-7］。FAT4为原钙黏蛋白家族成员之一，在细胞增殖及细胞平板极性调节中发挥重要作用［8-9］。有研究显示［10-12］，FAT4在肝癌、胃癌和乳腺癌等肿瘤中呈低表达，且进一步低表达可增强肿瘤细胞的增殖、侵袭能力。目前，尽管FAT4 涉及多种恶性肿瘤，但其在结直肠癌中的作用，特别是对继发性化疗耐药性的影响及机制仍不清楚。本研究对FAT4对结直肠癌继发性化疗耐药性问题进行分析，化疗药物选择奥沙利铂，因其应用较广泛，具有一定典型性。

FAT 家族成员能对Hippo信号通路进行调节，参与正常机体细胞发育、增殖过程，其中FAT4同样被发现可影响肿瘤进展［13］。另外，FAT4 还是重要的甲基化修饰因子，可导致基因突变的风险增加，降低基因 错 配 修 复 能 力［14-15］。研 究 证 实［16］，FAT4 高度甲基化能引发FAT4低表达，增强肿瘤细胞侵袭、迁移能力，还可限制YAPI的表达，对哺乳动物心脏生长造成影响。本研究发现，与空白组、对照组比较，实验组IC50值、RF降低，CCK-8实验A值降低，凋亡率增加，提示过表达FAT4 能抑制人结直肠癌HCT116细胞增殖，促进细胞凋亡，增强化疗敏感性。WEI R 等［17］研究也发现，FAT4过表达能抑制大肠癌细胞增殖，促进细胞凋亡，与本研究共同证实FAT4过表达的作用。

p53基因与其上、下游基因共同构成复杂的调控网络，其中MDM2-p53信号通路发挥重要作用。p53基因是一个经典抑癌基因，激活后能对下游一系列基因的表达产生影响，可促进细胞凋亡及DNA 修复，阻滞细胞周期进展。研究发现［18］，p53 失活在结直肠癌发生、发展过程中发挥重要作用。还有学者提出［19］，细胞在暴露于DNA 损伤药物后，可导致p53表达水平上升，推测p53可能在促进DNA 修复中有一定作用。MDM2主要作为p53的负性调控因子存在，可特异性标记p53蛋白，p53蛋白高表达可激活MDM2的转录和翻译，使p53蛋白被泛素-蛋白酶体系统降解，降低细胞内p53的含量。吕磊等［20］发现，膀胱癌耐药菌株增殖受MDM2-p53通路影响。本研究推测FAT4 过表达是否为调节HCT116 细胞内P53、MDM2表达，发挥增强HCT116细胞化疗耐药性作用。结果显示，实验组p-p53的蛋白相对表达量增高，MDM2蛋白的相对表达量降低，且Co-IP 实验证明FAT4与p-p53、MDM2有互相作用，提示过表达FAT4可调节p-p53、MDM2蛋白的表达。因此，推测FAT4过表达降低HCT116细胞化疗耐药性的作用机制，可能与调节MDM2-p53通路有关。

综上所述，FAT4 过表达可降低结直肠癌HCT116细胞化疗耐药性，增加化疗敏感性，该作用可能与MDM2-p53通路有关，这一结论可为临床指导结直肠癌化疗耐药治疗提供新方向。本研究不足之处在于，仅选用一个细胞株，未能全面概括FAT4对不同亚型细胞化疗耐药的影响及机制，故仍需深入研究，并在临床加以证实。