洛匹那韦固体脂质纳米粒的制备及药剂学性质评价

丁 瑞，高洋洋，赵 晔

大连市第三人民医院药剂部，大连 116033

洛匹那韦（LPV）是一种抗逆转录病毒蛋白酶抑制剂，用于预防和治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染［1］。LPV 属于生物制药分类系统（BCS）Ⅳ类药物，溶解性和渗透性均较差［2］，且存在较强的肝脏首过效应，口服生物利用度较低［3］。固体脂质纳米粒（SLNs）在提高难溶性药物的口服生物利用度方面表现出巨大的潜在应用价值，受到广泛关注［4］。本研究拟将LPV 开发成固体脂质纳米粒（LPV-loaded-SLNs），通过Box-Behnken 实验设计对其处方及制备工艺进行优化［5］，并对其药剂学性质进行初步评价，为评价LPV-loaded-SLNs在动物体内的药动学研究奠定实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

EClassical 3100高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；DF-101Q 系列集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；FSH-2A可调高速匀浆机（常州市金坛友联仪器研究所）；JY88-IIN 超声波细胞破碎仪（上海熙扬仪器有限公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪（英国Malvern公司）；DSC-500C 差示扫描量热仪（上海研锦科学仪器有限公司）；JEM-F200场发射透射电子显微镜（日本电子株式会社）。

1.2 试药

洛匹那韦（LPV，广州贝尔卡生物科技有限公司，质量分数为99.5%，批号LOP000126）；单双硬脂酸甘油酯（江西阿尔法高科药业有限公司）；泊洛沙姆188（德国巴斯夫公司）；二氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司）；纯化水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 LPV-loaded-SLNs的制备

采用乳化超声低温固化法制备LPV-loaded-SLNs［6］。取处方量的单双硬脂酸甘油酯和LPV 加入到二氯甲烷10 m L 中溶解，并通过旋转蒸发仪挥干有机溶剂，取固体混合物加热至75℃±1℃形成澄清透明的溶液，作为油相，保温备用；另取处方量泊洛沙姆188 溶解到纯化水20 m L 中，加热至75℃±1℃，作为水相，保温备用；将该热水相加入到油相中，使用高速匀浆机以4 000 r·min－1匀浆30 min，得到乳白色混悬液；最后使用超声波细胞破碎仪超声处理，在超声功率为200 W 条件下超声一定时间，将样品迅速用冰水浴冷却，得到LPV-loaded-SLNs。将样品储存在4℃～8℃冰箱中。

2.2 粒径分布测定

取少量2.1项下制备的LPV-loaded-SLNs，按照1∶100 的比例加入去离子水稀释，通过Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪测定粒径分布，光源为He-Ne激光器，波长为635 nm，入射角为90°，环境温度为25℃。每组样品重复测定3次，取平均值。

2.3 包封率测定

使用超滤技术测定LPV-loaded-SLNs 的包封率［7］。取LPV-loaded-SLNs 4 mL，置于超滤离心管（截留相对分子质量为10 000 Da）中，以3 000 r·min－1持续离心30 min，取出超滤液1 m L，加入流动相稀释至10 m L，作为游离药物样品（W游离）；另取同一批次LPV-loaded-SLNs 1 m L，置于50 m L量瓶中，加入乙腈5 m L，水浴超声10 min，溶液呈澄清透明状，再加入流动相稀释至刻度，作为总药物样品（W总）；上述2种样品溶液经0.22μm 滤膜过滤，并通过高效液相色谱（HPLC）法［8］测定，计算药物包封率：包封率＝（W总－W游离）÷W总×100%。

2.4 Box-Behnken实验设计

采用Box-Behnken实验设计考察脂药比（X1）、表面活性剂质量浓度（X2）和超声时间（X3）3种变量因素对LPV-loaded-SLNs的粒径分布（Y1）和包封率（Y2）的影响［9］，从而获得制备LPV-loaded-SLNs的最佳处方工艺。变量水平见表1，通过Box-Behnken实验设计随机化生成15组实验，结果见表2。

表1 Box-Behnken实验设计中变量及水平Tab.1 The variables and levels in Box-Behnken experimental design

表2 实验设计及结果Tab.2 The results of experimental design

通过Box-Behnken实验设计软件对数据进行线性（Linear）、双因子（2FI）和多元二次（Quadratic）模型拟合，并根据软件给出的矫正R2、预测R2和P值确定最佳拟合模型［10］。拟合模型选择结果见表3。Y1选择Quadratic模型，其矫正R2和预测R2分别为0.946、0.921 6，P值为0.005 2，最为适合，Y2选择Quadratic 模型，其矫正R2和预测R2分别为0.958 4、0.943 6，P值为0.000 2，也最为适合；方差分析结果见表4。由表4可知，脂药比（X1）、表面活性剂质量浓度（X2）和超声时间（X3）3个变量因素对LPV-loaded-SLNs的粒径分布（Y1）和包封率（Y2）的影响，并使用响应曲面图阐明了X1、X2和X33个变量因素与Y1和Y2之间的关系。

表3 拟合模型选择结果Tab.3 The results of regression model selection

表4 方差分析结果Tab.4 The results of ANOVA

脂药比（X1）、表面活性剂质量浓度（X2）和超声时间（X3）对LPV-loaded-SLNs的粒径分布（Y1）影响见图1。

由图1可知，在超声时间（X3）恒定时，粒径分布（Y1）随着脂药比（X1）的增加而表现出先减小后增大趋势，随着表面活性剂质量浓度（X2）的增加表现出先增大后减小趋势；在表面活性剂质量浓度（X2）恒定时，粒径分布（Y1）随着脂药比（X1）的增加和超声时间（X3）的延长出现减小趋势。

图1 脂药比（X 1）、表面活性剂质量浓度（X 2）和超声时间（X 3）对LPV-loaded-SLNs的粒径分布（Y 1）影响的响应曲面图Fig.1 The response surface graph of the effect of lipid-drug ratio（X 1），surfactant concentration（X 2）and ultrasonic time（X 3）on the particle size distribution（Y 1）of LPV-loaded-SLNs

脂药比（X1）、表面活性剂质量浓度（X2）和超声时间（X3）对LPV-loaded-SLNs的包封率（Y2）影响见图2。

由图2可知，在超声时间（X3）恒定时，包封率（Y2）随着脂药比（X1）和表面活性剂质量浓度（X2）的增加而增大。

图2 脂药比（X 1）、表面活性剂质量浓度（X 2）和超声时间（X 3）对LPV-loaded-SLNs的包封率（Y 2）影响的响应曲面图Fig.2 The response surface graph of the effect of lipid-drug ratio（X 1），surfactant concentration（X 2）and ultrasonic time（X 3）on the encapsulation efficiency（Y 2）of LPV-loaded-SLNs

以制备的LPV-loaded-SLNs粒径分布最小化、包封率最大化为目标［11］，通过Box-Behnken实验设计优化得到最佳处方工艺为：脂药比为4∶1，表面活性剂质量浓度为30 mg·m L－1，超声时间为10 min，预测LPV-loaded-SLNs的粒径分布为346.4 nm，包封率为90.1%。为了确认模型预测的可靠性，根据最佳处方工艺制备了3批LPV-loaded-SLNs，测得粒径分布为（351.5±5.8）nm，包封率为89.5%±1.4%，与预测值吻合度极高，证实了模型的预测可靠性。

2.5 微观形貌观察（TEM）

取LPV-loaded-SLNs 100μL，按照1∶100 的比例加入去离子水稀释，取上述样品滴加到碳涂层的铜网上，并均匀铺展，再滴加20 mg·m L－1磷钨酸钠溶液对样品进行染色，室温挥干水分，用透射电子显微镜观察LPV-loaded-SLNs的微观形貌。见图3。

由图3可知，LPV-loaded-SLNs呈球形分布，表面光滑，大部分粒子的粒径在200～400 nm 间分布，与动态光散射方法测定的粒径大小相似，文献报道表明该粒径大小有利于胃肠道吸收［12］。

图3 LPV-loaded-SLNs的透射电镜照片Fig.3 Transmission electron micrograph of LPV-loaded-SLNs

2.6 差示扫描量热法（DSC）

使用DSC 法对LPV 原料药、LPV 原料药与空白SLNs的物理混合物以及LPV-loaded-SLNs进行热分析，以初步判断LPV-loaded-SLNs中药物的存在形式［13］。分别称取上述4种样品各4～6 mg，置于铝盘中，密封，并以密封空铝盘作为对照。设置氮气流速为50 m L·min－1，升温速率为5℃·min－1，升温范围为25℃～200℃，结果见图4。

图4 LPV原料药（a）、物理混合物（b）和LPV-loaded-SLNs（c）的DSC图Fig.4 DSC thermograms of lopinavir API（a），physical mixture（b）and LPV-loaded-SLNs（c）

由图4 可知，LPV 原料药（a）和物理混合物中LPV 原料药（b）分别在126.5℃、127.2℃出现吸热峰，为LPV 结晶态的熔 点［14］；物理混合物中空白SLNs（b）和LPV-loaded-SLNs（c）分别在56.5℃、56.7℃出现吸热峰，该值与单双硬脂酸甘油酯的熔点（54℃～66℃）基本一致；LPV-loaded-SLNs（c）中药物在126.5℃附近的吸热峰消失，表明被包裹在SLNs中的LPV 以非晶态形式呈现［15］。

2.7 稀释稳定性

为了评价LPV-loaded-SLNs在不同p H 溶液中的抗稀释能力，取LPV-loaded-SLNs分别用p H1.2、p H4.5、p H6.8缓冲液稀释至100倍，在稀释后的0、2、4、6 h时间点观察外观［16］，取样检测LPV-loaded-SLNs的粒径分布，评估其物理稳定性，结果见表5。

表5 LPV-loaded-SLNs稀释稳定性结果（±s，n＝3）Tab.5 Dilution stability results of LPV-loaded-SLNs（±s，n＝3）

表5 LPV-loaded-SLNs稀释稳定性结果（±s，n＝3）Tab.5 Dilution stability results of LPV-loaded-SLNs（±s，n＝3）

介质溶液粒径分布／nm 0 h 2 h 4 h 6 h p H1.2 349.6±4.7 351.6±6.3 348.6±3.7 350.5±3.9 p H4.5 349.6±4.7 348.9±3.7 350.4±4.1 348.5±5.3 p H6.8 349.6±4.7 350.4±4.7 349.9±4.2 353.5±4.7

稀释稳定性实验结果显示，LPV-loaded-SLNs经p H1.2、4.5、6.8缓冲液稀释后6 h内，样品均未出现絮凝分层，也无药物沉淀析出，粒径基本无变化，表明LPV-loaded-SLNs在不同p H 溶液中具有良好的抗稀释能力，可以推测LPV-loaded-SLNs经口服给药进入胃肠道内可以保持完整性。

2.8 体外释放研究

采用体外释放实验测定了LPV-loaded-SLNs在p H1.2、4.5、6.8释放介质中的释放速率，用于模拟LPV-loaded-SLNs在胃肠道环境中的药物释放情况［17］。取LPV-loaded-SLNs 2 m L 置 于 透 析 袋（纤维素膜，截留相对分子质量为12 000 Da）中，密封后分别浸入到装有200 m L上述释放介质的烧杯中，外水浴温度为37 ℃±1 ℃，磁力搅拌速度为100 r·min－1，分别在实验开始后的1、2、3、4、6、8、10、12、24 h从烧杯中取出释放介质5 m L，并加入等量的空白释放介质，释放介质经0.22μm 滤膜过滤，并进行适当稀释，进样检测药物含量［8］，药物释放度结果见表6。

表6 LPV-loaded-SLNs在不同p H 介质中的体外药物释放度（±s，n＝6）Tab.6 In vitro drug dissolution of LPV-loaded-SLNs in different p H media（±s，n＝6）

表6 LPV-loaded-SLNs在不同p H 介质中的体外药物释放度（±s，n＝6）Tab.6 In vitro drug dissolution of LPV-loaded-SLNs in different p H media（±s，n＝6）

时间／h累积释放度p H1.2 p H4.5 p H6.8 1 21.4%±4.6% 24.1%±3.3% 19.6%±2.8%2 33.9%±3.3% 37.4%±3.4% 32.1%±2.7%3 41.2%±3.7% 43.5%±2.6% 37.5%±2.3%4 44.9%±2.8% 47.4%±3.6% 42.7%±3.2%6 52.3%±3.6% 51.6%±3.8% 48.2%±3.9%8 56.6%±2.4% 57.6%±2.7% 53.2%±3.8%10 61.0%±3.7% 62.7%±2.1% 59.8%±2.5%12 64.7%±2.3% 66.3%±2.1% 64.6%±2.6%24 88.2%±3.5% 91.3%±2.3% 88.5%±2.0%

体外药物释放度结果显示，LPV-loaded-SLNs在p H1.2、4.5、6.8释放介质中药物释放速率基本一致，说明不同p H 环境不会影响药物的释放速率。LPV-loaded-SLNs在3种释放介质中均表现为双相释放模式，大约35%的药物在2 h内从SLNs中释放出来，接下来药物呈现缓慢持续释放模式，直到24 h药物释放度达到90%左右。

3 讨论

在处方初步筛选时，本文选择单硬脂酸甘油酯和单双硬脂酸甘油酯作为脂质载体制备LPV-loaded-SLNs，其中采用单硬脂酸甘油酯制备的LPV-loaded-SLNs，其药物包封率较低，约为60%，这是由于单硬脂酸甘油酯分子为有序排列，会形成刚性结构［18］，固体脂质中容纳药物分子空间有限，不利于包裹药物；而以单双硬脂酸甘油酯制备的LPV-loaded-SLNs，其包封率明显提高，这是由于单双硬脂酸甘油酯是由单、双、三硬脂酸和棕榈酸构成的混合三酰甘油（单甘油酯约占40.0～55.0%，双甘油酯约占30.0%～45.0%，三酰甘油约占5.0%～15.0%）。与单硬脂酸甘油酯相比，单双硬脂酸甘油酯中的3种三酰甘油是以不规则、无序状态排列，因此有充足的空间包载药物分子［19］。

本文采用Box-Behnken实验设计对LPV-loaded-SLNs的处方工艺进行系统地研究，并通过测定粒径及透射电镜、DSC 和体外释放度等初步评估了LPV-loaded-SLNs的药剂学特性，后续需要通过动物实验进一步证实其能够改善LPV 的口服生物利用度。