仿制托吡司他片的制备及与原研药的溶出度一致性评价

刘元芬

江苏卫生健康职业学院，南京 211800

痛风是一种因体内嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所引起的晶体性关节炎，临床表现为高尿酸血症和尿酸盐结晶沉积所致的特征性急性关节炎［1］。高尿酸血症与痛风密不可分，高尿酸血症是痛风主要的生化基础［2］。托吡司他（topiroxostat）化学名为5-（2-氰基-4-吡啶基）-3-（4-吡啶基）-1，2，4-三唑，于2013年6月在日本批准上市［3］。该药与目前其他黄嘌呤氧化酶（XOR）抑制剂药物如别嘌呤醇和非布司他机制不同，托吡司他具有非嘌呤结构，通过与XOR 溶剂通道的氨基酸残基相互作用并形成共价键，抑制形成尿酸前嘌呤分解代谢的最后2个反应，减少尿酸的生成，对氧化型和还原型的氧化酶抑制剂均有抑制作用［4-6］，因此具有降低尿酸作用强、不良反应少、安全性好等优点。

目前托吡司他片尚未在我国上市销售，按照《药品注册管理办法》分类，属新药3.1类，托吡司他含量测定方法、溶出度一致性的研究对其上市进行临床试验非常重要［7］。因此本研究仿照原研制剂自制托吡司他片，并采用高效液相色谱（HPLC）法测定自制仿制片与原研片中托吡司他的含量，同时建立托吡司他溶出度测定方法学，比较原研药和自制片剂在50 g·L－1十 二 烷 基 硫 酸 钠（SDS）水 溶 液、0.1 mol·L－1盐酸 溶液、10 g·L－1SDS 醋酸溶 液（p H4.0）以及p H6.8磷酸盐缓冲液（PBS）4种溶出介质中的溶出度，采用相似因子（f2）评价原研药片和自制仿制药片的溶出曲线相似度，为后续的质量控制及体内研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

20AD 高效液相色谱仪，岛津SPD-20A 检测器和UV-1780紫外分光光度计，均购自日本岛津公司；AE-240电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒公司）；ZRS-8智能溶出仪（天津大学无线电厂）。

1.2 试药

乳糖（上海华茂药业有限公司）；微晶纤维素，羟丙基纤维素，硬脂酸镁和交联羧甲基纤维素钠，均购自安徽山河药用辅料股份有限公司；乙腈为色谱纯，购自美国Fisher公司；磷酸、氢氧化钠等试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 托吡司他片的制备

参照原研药品说明书［8］，将乳糖30 g、微晶纤维素15 g、羟丙基纤维素0.7 g和交联羧甲基纤维素钠1.75 g过80目筛备用；称取托吡司他20 g，用气流粉碎机粉碎。按照处方量称取粉碎好的托吡司他，乳糖、微晶纤维素、羟丙基纤维素和交联羧甲基纤维素钠（内加）置湿法混合颗粒机中混合，搅拌速度为100 r·min－1，切碎速度设为低速，混合时间为5～10 min；加纯化水适量，混合搅拌5～10 min，前2 min搅拌速度为100 r·min－1，切碎速度设为低速，后3～10 min搅拌速度为200 r·min－1，切碎速度设为高速，出料。将所制软材经多功能整粒机（20目）制湿颗粒，60℃干燥，（24目）进行整粒。将颗粒与交联羧甲基纤维素钠1.75 g（外加）和润滑剂硬脂酸镁0.35 g加入，压片即得。共制得仿制的托吡司他片1 000片（规格：20 mg）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为10 g·L－1磷酸溶液（用氢氧化钠调节p H 值至3.0）-乙腈（75∶25）；检测波长为275 nm［8］；理论塔板数按托吡司他峰计算应不低于3 000。

2.2.2 测定法 取本品20片，研细，称取适量，精密称定，加0.1 mol·L－1盐酸溶液2 m L，再加甲醇适量超声溶解，并用甲醇定量稀释制成每1 m L 中约含托吡司他0.05 mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密量取20μL 注入液相色谱仪，记录色谱图；另取托吡司他对照品，精密称定，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得自制托吡司他片中的药物含量。共测定6批托吡司他片中的药物含量，每批平行测定3 次。经计算得6 批样品的平均药品含量为100.32%±0.40%。见表1。

表1 6批仿制托吡司他片样品含量测定结果（±s，n＝3）Tab.1 Content determination results of 6 batches of self-made Topiroxostat Tablets samples（±s，n＝3）

表1 6批仿制托吡司他片样品含量测定结果（±s，n＝3）Tab.1 Content determination results of 6 batches of self-made Topiroxostat Tablets samples（±s，n＝3）

批号 含量1 2 3平均含量2020082101 100.35% 100.12% 99.87% 100.11%2020082201 99.96% 99.82% 100.01% 99.93%2020082202 100.60% 100.39% 99.76% 100.25%2020082301 99.81% 99.83% 100.40% 100.01%2020082302 101.06% 101.02% 100.67% 100.92%2020082303 100.56% 100.57% 100.98% 100.70%平均含量 100.39%±0.46% 100.29%±0.47% 100.28%±0.48%100.32%±0.40%

2.3 溶解度试验

参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版二部凡例实验［9］。将托吡司他原料药研细，称取本品细粉适量，置于具塞锥瓶中，分别加相应溶液溶解，置于20℃±5℃环境中，每隔5 min振摇30 s，在30 min内观察溶解情况，以在溶液中看不到沉淀时，即认为完全溶解，最小漏槽体积按最高剂量溶解体积的3倍计算，结果见表2。

表2 托吡司他原料药在不同p H 值缓冲液中的溶解度Tab.2 Solubility of topiroxostat API in different p H buffers

从实验结果可知，托吡司他原料药的溶解度受p H 值影响很大。

2.4 溶出度测定方法的建立

2.4.1 检测波长的选择 取托吡司他对照品适量，用适量的0.1 mol·L－1盐酸溶液溶解后，再用各溶出介质稀释成含托吡司他6μg·m L－1的溶液，按照紫外-可见分光光度法进行扫描，50 g·L－1SDS水溶液、0.1 mol·L－1盐酸溶液、p H4.0 醋 酸盐缓冲 液（含10 g·L－1SDS）和p H6.8 PBS中药物的最大吸收波长分别为284、279、275、276 nm。测得的最大吸收波长将作为后续检测波长。

2.4.2 药物在各溶出介质中的工作曲线 精密称取托吡司他对照品20 mg，置于100 m L 量瓶中，加0.1 mol·L－1盐酸溶液及甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液母液。分别精密量取母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m L，置于100 m L 量瓶中，用各溶出介质稀释至刻度，摇匀，分别制成含托吡司他 2、4、6、8、10μg·m L－1的系列质量浓度溶液。

取上述溶液，以各溶出介质为空白，照紫外-可见分光光度法（参考《中国药典》四部）在各溶出介质的最大吸收波长处分别测定其吸光度值A，以吸光度值A为纵坐标，质量浓度C为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。见表3。

表3 托吡司他在各溶出介质中的标准曲线Tab.3 Standard curves of topiroxostat in different dissolution media

2.4.3 各溶出介质中的药物稳定性 精密称取托吡司他对照品适量，用0.1 mol·L－1盐酸溶液溶解，再用各溶出介质定量稀释成质量浓度约为6μg·m L－1的样品溶液。按照紫外-可见分光光度法，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h，在各溶出介质最大吸收波长处测定其吸光度值A。结果显示，托吡司他在各溶出介质中放置8 h均稳定。见表4。

表4 托吡司他在各溶出介质中不同时间的吸光度值ATab.4 The absorbance value of topiroxostat at different times in different dissolution media

2.4.4 溶出精密度实验 取本品2个批次的片剂各1片（批号：20200818、20200816），按照“溶出度”项下的测定方法操作，45 min 时，取溶出液，经0.45μm滤膜滤过，取续滤液4 m L，置于10 m L 量瓶中，用溶出介质50 g·L－1SDS水溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液，各平行配制6份。按照紫外-可见分光光度法，分别在284 nm 波长处测定吸光度值A。结果表明，该溶出度测定法精密度良好，RSD 值为0.28%。

2.4.5 滤膜吸附实验 取“溶出精密度实验”项下20200816批样品的溶出液适量，采用高速离心法，取上清液2.5 m L，置于20 m L 量瓶中，用溶出介质50 g·L－1SDS水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液1；另取“溶出精密度实验”项下20200816 批的溶出液适量，分别经0.45μm 的微孔滤膜（水系和有机系）过滤，取续滤液2.5 m L，置于20 m L 量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为供试品溶液2和3。

分别取供试品溶液1、2、3，按照紫外-可见分光光度法，在284 nm 波长处分别测定吸光度值A。测得平均吸光度值为0.616，RSD 值为0.001 4。结果表明，与离心处理的样品相比，水系和有机系滤膜过滤的样品的吸光值A基本无差异，由此可见，滤膜过滤对样品溶液无吸附作用，采用滤膜过滤不会影响溶出度的测定。

2.4.6 回收率试验 分别精密称取托吡司他对照品约0.10（50%）、0.16（80%）、0.22 g（110%），置于①、②和③号研钵中，再取专属性项下的混合空白辅料，分别精密称取空白辅料约0.5 g（约相当于20 mg片剂的10片辅料量），置于3个研钵中，研匀。从①号研钵中精密称取细粉3份（约含托吡司他10.0 mg）；从②号研钵中精密称取细粉3 份（约含托吡司他16.0 mg）；从③号研钵中精密称取细粉3份（约含托吡司他22.0 mg）。将上述9 份细粉分别置于100 m L量瓶中，加溶出介质50 g·L－1SDS水溶液适量，超声15 min，用溶出介质稀释至刻度，摇匀；取上述样品溶液，经0.45μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液2 m L，置于50 m L量瓶中，加溶出介质定量稀释至刻度，即得样品溶液。

另取托吡司他对照品适量，精密称定，加0.1 mol·L－1盐 酸 溶 液 适 量 溶 解，用 溶 出 介 质50 g·L－1SDS水溶液定量稀释制成每1 m L 约含托吡司他8μg·m L－1的对照品溶液。按照紫外-可见分光光度法，在284 nm 波长处分别测定吸光度值A。计算回收率与相对标准偏差，实验结果见表5。结果表明，分别加入相当于药物制剂含量50%、80%、110%时，托吡司他的回收率为98.3%～101.6%，相对标准偏差为1.30%，符合测定要求，说明本方法可以准确地测出溶出液中托吡司他的含量。

表5 托吡司他药物回收率实验结果Tab.5 Results of topiroxostat recovery test

2.4.7 溶出转速的选择 将溶出转速分别设置为桨法50 r·min－1和75 r·min－1，其余溶出条件不变，将原研药品分别置于水溶液、含50 g·L－1SDS水溶液、p H4.0醋酸盐缓冲液和p H6.8PBS 中观察溶出行为。结果显示，转速对托吡司他片溶出行为影响不大。因此选择50 r·min－1桨法作为溶出转速。见表6。

表6 不同转速下原研药片药物的溶出度Tab.6 The drug dissolution of the original Topiroxostat Tablets at different speeds

2.5 溶出一致性评价

2.5.1 溶出度的测定 取本品，按照溶出度测定法（《中国药典》2020年版四部），以900 m L各种溶液为溶出介质，转速为50 r·min－1，依法操作，45 min时，取续滤液4 m L，置于量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；按照紫外-可见分光光度法，在最大吸收波长处分别测定吸光度值A。另取托吡司他对照品适量，精密称定，加0.1 mol·L－1盐酸溶液及甲醇适量溶解，再用各溶出介质定量稀释制成每1 m L 约含托吡司他8μg·m L－1的对照品溶液，同法测定，计算每片不同时间药物累积溶出百分率。见表7。

表7 不同溶出介质中仿制片和原研片的溶出度比较Tab.7 Comparison of the dissolution profiles of self-made tablets and original tablets in different dissolution media

2.5.2 相似度计算 利用公式计算并比较仿制药和原研药溶出曲线相似度［10-12］。

公式中T和R分别为仿制药和原研药的各取样点的平均溶出度，n为取样点个数，当f2因子数值计算结果大于50，可以认为两者在溶出介质水中溶出度曲线相似。在50 g·L－1SDS水溶液、0.1 mol·L－1盐酸溶液、p H4.0醋酸盐缓冲液（含10 g·L－1SDS）和p H6.8PBS的相似因子结果分别为76.16、90.54、68.18、58.07。但由于在0.1 mol·L－1盐酸溶液中，药物释放太快，因此综合考虑选择50 g·L－1SDS水溶液作为托吡司他仿制药质量控制的溶出介质。

3 结论

托吡司他仿制片目前在我国并未上市，文献多报道合成方法［13-14］和杂质的检测方法［15-16］，目前溶出度一致性评价并未见报道，但是一致性评价对仿制药的开发非常重要。本研究首先按照原研药的相关资料制备了托吡司他片，并建立了托吡司他溶出度测定方法。最后选择4种溶出介质对自制片和原研药溶出相似度进行比较，结果显示，自制仿制药片和原研药在4种溶出介质中的溶出度曲线相似因子均高于50，进一步证明了自制托吡司他仿制片与原研药在体外溶出实验中，质量近似。综合考虑取样点数量和相似因子，最终选择50 g·L－1SDS水溶液作为质量标准中的溶出介质。综上所述，托吡司他溶出度测定方法精密度、准确度和灵敏度高；经检测自制托吡司他片与原研药溶出行为一致，这些结果为托吡司他仿制药的进一步研究和开发奠定了基础。