复合酶法提取褐藻可溶性膳食纤维的工艺优化及其抗氧化功能测定

刘雨萌 ， 冷 嵩， 萨仁高娃

(1. 珠海科技学院 药学与食品科学学院， 广东 珠海 519041；2. 珠海科技学院 计算机学院， 广东 珠海 519041)

海藻是一种兼具食用和药用价值的大型藻类， 也是我国海水养殖的重要品种之一. 研究表明， 褐藻糖胶与海藻膳食纤维具有降血脂、 降血糖、 抗凝血、 缓解便秘、 多种免疫调节功能以及生物活性[1]， 是一种营养价值极高的功能性食品. 目前我国海藻工业的加工提取技术较差， 导致海藻的利用率较低. 研究表明， 我国有超过9%的居民摄入膳食纤维量不足， 远低于每日推荐的30%摄入量[2]. 因此， 海藻膳食纤维产品开发将会有巨大的经济价值和社会价值， 市场前景广阔.

褐藻是我国沿海地区常见的大型海藻之一， 目前主要采用乙醇沉淀法[3]和微波辅助提取法[4]进行褐藻可溶性膳食纤维素(SDF)的提取. 酶法具有反应条件温和、 绿色、 环保、 高效等优点[5]. 当产品中有超过10%的SDF时， 其具有较强的生理功能和保健功能. SDF在多数天然产品中的含量均较低， 通常存在不溶性杂质. 可使用特定酶将膳食纤维的糖苷键断裂， 使大分子变成小分子， 进而提高其溶解性， 同时会提高SDF含量， 并且得到的SDF具有更好的理化性质. 通过向原材料中加入某些特定的酶如水解淀粉的淀粉酶、 水解蛋白质的蛋白质酶进行酶法改性， 从而提高膳食纤维的纯度； 或加入纤维素酶作用于纤维素糖苷键， 破坏其大分子长链， 以得到更多的小分子， 从而提高SDF的溶解性. 复合酶水解膳食纤维素可使SDF产率更高[6-10]， 目前用复合酶法提取褐藻可溶性膳食纤维尚未见文献报道.

基于我国人群营养状况现状， 选取广东地区易得且廉价原料褐藻进行研究， 采用复合酶提取褐藻SDF， 并考察其理化性质和抗氧化功能， 为褐藻功能性食品研究提供可靠的理论支持.

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

褐藻产自广东珠海附近海域海岸沿线， 由珠海科技学院药学与食品科学学院申斯乐教授鉴定； 纤维素酶(50 U/mg， 其中U为25 ℃下， 1 min内能转化1 μmol底物的酶量)、α-淀粉酶( 4 U/mg) 、 木瓜蛋白酶 (10 U/mg)购自上海源叶生物科技有限公司； 半纤维素酶(105U/g)购自河北润步生物科技有限公司； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基和2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS·)自由基试剂购自大连美仑生物技术有限公司； 盐酸、 无水乙醇、 氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司， 分析纯试剂.

恒温水浴锅(H-6型， 常州澳华仪器有限公司)； 分析天平(AR552CN型， 德国赛多利斯科学仪器公司)； 紫外分光光度计(SP-752型， 上海光谱仪器有限公司)； 冷冻干燥机(ALPHA 1-2 LD plus型， 德国 Christ公司).

1.2 方 法

1.2.1 褐藻 SDF 提取

1) 工艺流程. 褐藻烘干处理→超微粉碎→加入复合酶进行酶解→蛋白酶水解→加入30倍w=1%碳酸钠溶液→65 ℃水浴2 h→φ=95%乙醇脱水→冷冻干燥→海藻SDF干粉.

2) 复合酶. 用m(纤维素酶)∶m(半纤维素酶)∶m(α-淀粉酶)=20∶5∶1进行褐藻SDF提取. 精准称取5.00 g的褐藻粉样品， 将样品置于烧杯中并加入适量蒸馏水， 先调节溶液pH=6.5， 再加入复合酶， 水浴加热过程中用玻璃棒不停搅拌.

3) 褐藻SDF提取率的计算公式为

提取率SDF=m/M×100%，

其中m为可溶性膳食纤维的干质量(g)，M为褐藻粉的干质量(g).

1.2.2 提取条件的单因素实验

精准称量5.00 g褐藻粉， 置于100 mL烧杯中， 以m(固， g)∶V(液， mL)=1∶20(固液比)、 60 min的酶解时间、 60 ℃的酶解温度、w=1.5%的复合酶(根据干粉质量计算)为基本条件， 依次改变某一条件研究其对褐藻SDF提取率的影响. 确定复合酶的酶解时间依次为20，40，60，80，100 min; 固液比依次为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 g/mL； 将酶解温度依次调至35，45，55，65，75 ℃； 复合酶的添加量(质量分数)依次为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%.

1.2.3 提取条件的响应面实验

用Design Expert 10.0软件的Box-Behnken法， 将自变量设为A: 复合酶添加量;B： 复合酶酶解时间;C: (固液比)-1;D: 复合酶酶解温度. 以褐藻 SDF 提取率为响应变量， 根据单因素提取的实验结果， 确定自变量的水平编码， 结果列于表1.

表1 Box-Behnken 方案设计的因素及水平编码

1.2.4 褐藻 SDF 理化性质测定

1) 持水力的测定. 持水力是当没有大气压力和重力的情况下， 样品对水分结合的能力. 精确称取褐藻膳食纤维1.00 g于烧杯中， 加入适量水摇匀， 室温放置1 h. 膳食纤维吸水后用滤纸过滤， 称取结合水后的褐藻SDF. 将SDF吸水前后的质量差除以1.00 g， 即得膳食纤维持水力(g/g).

2) 膨胀力的测定. 精确称取褐藻膳食纤维1.00 g于量筒中， 先记录SDF初始体积, 再加入适量蒸馏水摇匀， 室温静置24 h， 记录SDF吸水后的体积, 吸水前后的体积差为膳食纤维膨胀力(mL/g).

1.2.5 褐藻SDF的抗氧化能力测定

采用DPPH·自由基清除能力和ABTS·自由基清除能力两种方法测试褐藻SDF抗氧化作用[11].

1) DPPH·自由基清除能力测试. 将冻干褐藻 SDF配成质量浓度分别为0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 mg/mL的溶液. 总反应体系为4 mL， 终质量浓度为配置样品质量浓度的1/4. 按文献[12]方法测定褐藻SDF对DPPH·自由基的清除能力.

2) ABTS·自由基清除能力测试. 按文献[12]方法测定褐藻SDF的ABTS·自由基清除能力.

1.3 数据处理

每组数据取3次实验的平均值. 用软件 SPSS 18.0和graph 8.0分别进行单因素方差分析和绘制图表， 数据用(平均值±标准差)表示.

2 结果与分析

2.1 褐藻 SDF 单因素实验

2.1.1 复合酶酶解时间对提取率的影响

图1为复合酶酶解时间对提取率的影响. 由图1可见： 当酶解时间为20～60 min时， 褐藻SDF 提取率逐渐增加； 酶解60 min时的提取率最大； 继续增加酶解时间， 褐藻SDF提取率降低. 因此最佳的酶解时间为60 min.

国内外学者都在商务合同的研究上取得了丰富的成果，但他们的研究重点有所不同。海外学者专注于研究商务合同的特征，而中国学者则更加关注商务合同的风格特征及其翻译。整体而言，我国的商务英语翻译研究起步较晚。商务合同兼具商务英语和法律英语的特点，因此使得商务合同翻译的难度加大。令人欣慰的是，我国学者近年来对于这一领域的研究明显增多和加强。在商务英语合同翻译的文本特征、翻译标准和翻译方法等方面均有涉猎。

图1 复合酶酶解时间对提取率的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time of complex enzyme on extraction rate

2.1.2 酶添加量对褐藻 SDF提取率的影响

图2为酶添加量对褐藻 SDF提取率的影响. 由图2可见： 当酶添加量为0.5%～2.0%时， 褐藻SDF提取率随酶添加量的增加而上升， 此时酶和底物充分反应； 当酶添加量超过2.0%时， SDF提取率开始下降， 可能由于过量的酶会作用于可溶性膳食纤维， 导致提取率降低. 因此最佳的酶添加量为2.0%.

图2 酶添加量对褐藻 SDF提取率的影响Fig.2 Effect of enzyme addition on extraction rate of brown algae SDF

2.1.3 固液比对褐藻SDF提取率的影响

图3为固液比对褐藻SDF提取率的影响. 由图3可见， 褐藻SDF提取率随固液比的减小而升高， 之后趋于平稳. 综合考虑成本和提取率两方面因素， 设置1∶25为最佳固液比.

图3 固液比对褐藻SDF提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of brown algae SDF

2.1.4 酶解温度对褐藻 SDF 提取率的影响

图4为酶解温度对褐藻SDF提取率的影响. 由图4可见： 当酶解温度为35～55 ℃时， 褐藻SDF提取率随温度上升而增加; 温度为 55 ℃时的提取率最大, 之后提取率逐渐下降. 温度对酶活影响较大： 适宜温度下酶能达到最高活性； 但当温度过高时， 酶活下降， 甚至失活， 进而降低提取效率. 因此最佳的酶解温度为55 ℃.

图4 酶解温度对褐藻SDF提取率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of brown algae SDF

2.2 褐藻 SDF 的响应面优化实验

2.2.1 响应面回归模型的建立和方差分析

表2 响应面实验结果

使用 Design Expert 10.0 对实验数据进行拟合， 得到二次多项式回归方程为

Y(%)=37.71+2A+3.45B+0.042C-1.93D-0.17AB-0.22AC+0.37AD+

0.24BC-0.67BD+0.54CD-2.77A2-3.80B2-0.75C2-5.93D2.

表3 回归模型与方差分析结果

2.2.2 响应面分析

三维响应面是回归方程的图形表现形式， 可预测和检验变量和响应值与各变量水平间的相互作用关系． 图5为响应值对应各实验因素(A,B,C,D)分别对褐藻SDF提取率的影响．利用Design-Expert软件进行拟合的回归方程计算， 预测酶解法对褐藻SDF提取的最佳工艺条件是： 73.88 min的酶解时间, 2.17%的加酶量, 1∶24.95的固液比, 53.22 ℃的酶解温度. 在最佳条件下， 最大SDF提取率为39.02%. 考虑实际情况， 将工艺参数调整为: 1∶25的固液比, 2.2%的加酶量, 75 min的酶解时间, 55 ℃的酶解温度. 该实验条件下进行3组平行实验， 得到褐藻 SDF提取率为38.15%±0.24%， 相对误差为2.23%. 预测值与实验值无显著性差异(P>0.05)， 表明模型预测结果正确， 能准确反映提取中各影响因素对褐藻SDF 提取率的影响情况.

图5 响应值对应各实验因素对褐藻SDF提取率的影响Fig.5 Effect of response values corresponding to various experimental factors on extraction rate of brown algae SDF

2.3 褐藻SDF的理化性质

SDF的质量可通过持水性和膨胀性等理化性质进行评估. 在最佳的提取条件下得到褐藻 SDF， 其膨胀力和持水力分别为(53.7±0.4)mL/g和(24.6±0.3)g/g， 可见复合酶提取后的褐藻SDF具有良好的持水力和膨胀力. 高持水性可增加粪便质量， 高膨胀力可增加粪便体积， 从而刺激肠道达到促进排便的功效[13-14].

2.4 褐藻SDF抗氧化测定结果

不同质量浓度褐藻SDF与对照药维生素C(VC)的DPPH·自由基清除率如图 6所示. 由图6可见， 当质量浓度为 0.5 mg/mL 时， SDF的DPPH·自由基清除率可达75.77%， 表明高质量浓度SDF对 DPPH·自由基有较强的清除能力.

***P<0.01差异极显著； **P<0.05差异显著.

ABTS·自由基的清除能力是一种重要的抗氧化能力评价标准， 当存在抗氧化物时， 其溶液颜色变浅， 734 nm处的吸光值降低， 吸光值越小样品的抗氧化能力越强. 不同质量浓度褐藻SDF与对照药2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的ABTS·自由基清除率如图7所示. 由图7可见， 褐藻SDF质量浓度越大， ABTS·自由基清除能力越强[15]， 且二者呈正相关， 当质量浓度为160 μg/mL时， 与对照药BHT无显著性差异.

***P<0.01差异极显著; **P<0.05差异显著; *P>0.05无显著差异.

对ABTS·与DPPH·自由基的清除能力是评价样品抗氧化能力的常用方法. 抗氧化能力与细胞衰老和炎症有关[16]， 表明褐藻SDF在抗衰老和抗炎方面具有潜在的应用价值.

综上所述， 本文使用复合酶提取褐藻 SDF， 其最佳条件为75 min的酶解时间, 2.2%的加酶量, 55 ℃的酶解温度, 1∶25的固液比. 该条件下褐藻SDF提取率最大为38.15%， 持水力和膨胀力分别为(24.6±0.3)g/g和(53.7±0.4)mL/g. 当褐藻SDF质量浓度为0.5 mg/mL时， DPPH·自由基清除率为75.77%； 当褐藻SDF质量浓度为160 μg/mL时， 与对照药BHT对ABTS·自由基的清除率已无显著性差异. 可见， 通过复合酶提取褐藻SDF， 其提取率较高， 具有良好的持水力、 膨胀力和抗氧化活性.