精子正常形态率对补救ICSI结局影响及补救ICSI临床价值分析*

陈其桂 李大文** 成俊萍 何泳志 庞太森 黄泰帅

1.广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心（南宁 530021）；2.广西壮族自治区妇幼保健院生殖中心（南宁 530003）

目前，在体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer,IVF-ET）助孕中，有70-80%受精率，但在精液参数分析正常的患者中，仍有一定概率遇到完全受精失败（total fertilization failure,TFF）或部分受精失败（partial fertilization failure,PFF）的状况[1]，这既对病人精神及经济造成损伤，也令医生沮丧与困扰。多种因素均可导致受精失败，如体内激素水平、卵母细胞质量、精子质量异常、减数分裂异常和精卵结合异常等[2，3]。在这些因素中，主要缘由可能是精卵结合异常。

一些研究[4-6]表明，精子正常形态率（Normal sperm morphology rate，NSMR）是导致男性生育力下降、常规IVF失败的重要原因。鉴于近年来生殖学者们报道的有关精子形态对于体外受精结局的重要预测价值，畸形精子症（简称畸精症）的定义一直被世卫组织所修正，1992年参考数值为＜30%，1999年为＜14%，2010年下调至＜4%[7]。此研究中，我们将NSMR＜4%定义为畸精症。为了能够挽救IVF周期，学者们提出了补救ICSI（rescue intracytoplasmic sperm injection,R-ICSI），此方法由Nagy ZP等在1993年提出并报道,目前已被广泛应用并取得成功[8]。然而，关于NSMR是否会影响R-ICSI治疗结局目前尚不清楚。为此，本研究旨在探讨精子正常形态率对R-ICSI助孕结局的影响，评估NSMR在预测R-ICSI临床结局中的作用。同时，回顾性分析IVF完全受精失败或部分受精失败下R-ICSI的治疗情况，以探讨临床可行性及价值。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2014年1月-2019年12月在广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心接受R-ICSI的137对不孕夫妇，女方基础性激素水平及B超检查示卵巢功能正常。

R-ICSI适应症及治疗：以第二极体作为早期受精的判断标准，若授精6小时观察所有成熟卵子中出现明确第二极体的比例＜30%，建议行R-ICSI。对未排出第二极体的卵母细胞，在授精后6-8小时行R-ICSI治疗。

入选标准：（1）女方年龄小于38岁；（2）精子来源均为丈夫且通过手淫获取；（3）所有患者染色体核型检查正常；（4）超排卵用药方案为长方案；（5）新鲜移植周期的胚胎均来自R-ICSI。

排除标准：（1）男方服用影响精子质量的药物；（2）女方子宫腺肌症、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征；（3）夫妇双方生殖器发育异常、生殖系统感染等。

根据常规IVF受精情况及不同精子正常形态率进行分组：

常规IVF完全受精失败行R-ICSI：NSMR＜4%组（n=41）和NSMR≥4%组（n=34）；

常规IVF部分受精失败行R-ICSI：NSMR＜4%组（n=37）及NSMR≥4%组（n=25）。

二、研究方法

（一）促排卵方案

采用促性腺激素释放激素激动剂（达菲林，益普生公司）/促卵泡生成素（果纳芬，瑞士雪兰诺）和（或）人绝经期促性腺激素（HMG，珠海丽珠制药）/人绒毛膜促性腺激素（HCG，瑞士雪兰诺）长方案促排卵。自用促性腺激素4d后开始B超监测卵泡发育，当有2个卵泡直径＞18mm时，于当晚21:00左右予HCG 10000IU肌肉注射，给药36h于手术室在阴道B超引导下行经阴道超声穿刺取卵。

（二）精液采集

男性患者禁欲2～7天，采用手淫法取精液置于干燥消毒量杯内，标本维持20～37℃转送至实验室，置于37℃恒温箱内液化。

（三）精子正常形态率

采用WHO推荐的Diff-Quik快速染色方法精液涂片进行染色。精子形态评估：评估精子形态时采用严格标准，只有精子头、颈、中段和尾部均正常的精子才认为是正常精子。染色后，至少计数200个精子，确定正常精子的形态率。《人类精液检查与处理实验室手册》第5版关于精子形态标准：（1）精子头部外形上应光滑、规则，大体上呈椭圆形；顶体界限清晰，占头部的40%-70%，（2）中段应细、规则，大约与头部长度相等，并且主轴与头部长轴一致，（3）主段应是直的，均一的，比中段细，长约45um。《人类精液检查与处理实验室手册》第5版标准：精子正常形态率正常参考值≥4%。

（四）受精、卵裂、胚胎移植及妊娠情况

R-ICSI后第1天观察卵子受精情况，以双原核（2PN）卵子作为正常受精卵。受精后培养3天观察胚胎状况，根据胚胎的卵裂球数目、胚胎碎片及卵裂球大小的均一度三方面综合评估[9]，选择优质胚胎进行移植，移植胚胎数≤3个，剩余Ⅲ级以上胚胎冷冻保存，并同时予黄体支持。

（五）妊娠判定及随访

移植术后14天检测血β-HCG水平，阳性则确立生化妊娠，于4～6周行B超检查，若B超见宫腔内孕囊及心管搏动则确立临床妊娠。我科相关人员电话随访并记录最终结局。

三、计算指标

（一）受精率=受精卵子数/MII卵子数

（二）正常受精率=2PN卵子数/MII卵子数

（三）卵裂率=卵裂数/受精卵子数

（四）优胚率=优质胚胎数/2PN卵裂数

（五）种植率=孕囊数/移植胚胎数

（六）临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期例数

（七）活产率=活婴分娩数/移植周期例数

（八）流产率=临床流产例数/临床妊娠例数

四、统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析数据，计量资料满足正态分布，以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；如不符合正态分布则以中位数（最小值，最大值）[M（min，max）]表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料采用[n（%）]进行表示，使用卡方检验进行差异比较。P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、NSMR＜4%组与NSMR≥4%组一般情况比较（TFF）

两组患者不育年限、男方年龄、女方年龄、基础FSH值、基础LH值、窦卵泡数、HCG日子宫内膜厚度、获卵数均无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 R-ICSI周期NSMR＜4%组与NSMR≥4%组一般情况比较（TFF）

二、NSMR＜4%组与NSMR≥4%组结局比较（TFF）

两组患者行R-ICSI时受精率、正常受精率、卵裂率、优胚率、种植率、临床妊娠率、活产率及流产率均无显著差异（P＞0.05），见表2。

三、NSMR＜4%组与NSMR≥4%组一般情况比较（PFF）

两组患者不育年限、男方年龄、女方年龄、基础FSH值、基础LH值、窦卵泡数、HCG日子宫内膜厚度、获卵数均无显著差异（P＞0.05），见表3。

表3 R-ICSI周期NSMR＜4%组与NSMR≥4%组一般情况比较（PFF）

四、NSMR＜4%组与NSMR≥4%组结局比较（PFF）

两组患者受精率的比较差异有统计学意义（P＜0.05）。但是，两组患者正常受精率、卵裂率、优胚率、种植率、临床妊娠率、活产率及流产率均无显著差异（P＞0.05），见表4。

表4 R-ICSI周期NSMR＜4%组与NSMR≥4%组结局比较（PFF）

五、R-ICSI周期（TFF或PFF）胚胎发育及妊娠结局

（一）常规IVF完全受精失败的R-ICSI周期（新鲜移植周期的胚胎来源均为R-ICSI）：共75个新鲜周期，53个新鲜移植周期，22个取消周期，共722个未受精卵，545个MII期卵子行补救ICSI，卵子再利用率为75.48%（545/722），70.67%（53/75）周期获得移植。受精卵子数为449个，2PN受精卵子数为406个，卵裂数为440个，2PN卵裂数为397个，优质胚胎数为162个。受精率为82.39%（449/545），正常受精率为74.50%（406/545），卵裂率为98.00%（440/449），优胚率为40.81%（162/397）。总共移植100枚胚胎，孕囊数32个，种植率为32.00%（32/100）。临床妊娠24例，共22位患者分娩，29个活产儿（单胎15个，双胎7个），20个足月产，2个早产，2例流产。

（二）常规IVF部分受精失败的R-ICSI周期（新鲜移植周期的胚胎来源均为R-ICSI）：共62个新鲜周期，32个新鲜移植周期，30个取消周期，共709个未受精卵，549个MII期卵子行补救ICSI，卵子再利用率为77.43%（549/709），51.61%（32/62）周期获得移植。受精卵子数为467个，2PN受精卵子数为389个，卵裂数为456个，2PN卵裂数为382个，优质胚胎数为166个。受精率为85.06%（467/549），正常受精率为70.86%（389/549），卵裂率为97.64%（456/467），优胚率为43.46%（166/382）。总共移植61枚胚胎，孕囊数16个，种植率为26.23%（16/61）。临床妊娠15例，共11位患者分娩，12个活产儿（单胎10个，双胎1个），10个足月产，1个早产，2例流产，2例异位妊娠。

讨 论

发生IVF受精失败，会带来沮丧感及繁重的经济负担。受精是一个复杂的进程，据报道，在常规IVF周期中，约3%-5%有受精失败的风险[10]。据研究报道[11]，发生受精失败的其中一个原因是由于精子未能与透明带成功结合或未能穿越透明带。R-ICSI可以通过机械穿透卵细胞膜而绕过生物学障碍，增加患者受孕机会，故在未取消该周期的情况下实施R-ICSI是一种值得尝试的方法。另一种方案是取消当前IVF周期。相关研究表明[12，13]，与取消周期的方法相比，早R-ICSI是值得应用的补救方案，可获得不错的临床妊娠结局。

高质量胚胎的产生需要高质量的配子，精子形态一直是生殖医师评估男性生育力的重要实验室参数，对成功受精具有重要影响。各种负面环境因素或内在因素都可能会影响精子形态，造成头部、中段或尾部缺陷。学者们已对精子形态与IVF/ICSI结局的关系进行了大量的研究。史轶超等[14]研究发现精子形态完整性与IVF受精率、正常受精率、可移植胚胎率有关，但与活产率、流产率关系仍需进一步验证。另一项研究[15]也提到，IVF受精率可因精子头部畸形而下降。当NSMR≤4%时，IVF总体受精率降低，当NSMR≤3%时，IVF正常受精率下降。Li B等[7]则探讨了不同精子形态在体外受精选择方式上的作用，发现NSMR与胚胎发育潜能呈显著正相关，认为当NSMR＜4%时，应首选ICSI进行辅助生殖助孕，而当NSMR≥4%，常规IVF助孕方案应优先选择。Zahiri Z等[16]学者研究指出，在ICSI周期中，不同的精子形态（如大、小和无顶体）影响染色质的完整性及其凝聚，并降低精子的生育潜能及妊娠率。而一项关于2202个IVF周期和2574个ICSI周期的研究指出，在IVF/ICSI周期中，畸形精子症对妊娠结局的影响是有限的，此外，IVF/ICSI出生缺陷风险没有增加[17]。

然而，目前关于精子正常形态率对R-ICSI治疗结局影响的研究，国内外鲜有文献报道，且纳入及排除标准不一。为此，本研究根据IVF受精失败情况分为RICSI（TFF）及R-ICSI（PFF），再分别比较NSMR＜4%和NSMR≥4%的胚胎发育情况及临床结局。结果发现，在R-ICSI（TFF）中，NSMR＜4%组与NSMR≥4%组的基本资料、胚胎发育情况及临床结局均无显著性差异。这与Li M等[18]学者研究报道一致，畸精症对R-ICSI患者的临床结局没有影响。分析原因可能为：受精过程涉及到一系列蛋白反应和蛋白相互作用，精卵异常及二者之间相互作用蛋白的缺失或功能异常，均可导致受精失败[19]。Anifandis G等[20]学者研究报道，与ICSI受精失败相关的一个已知因素是卵母细胞激活缺陷，而精子磷脂酶Cζ亚型（phospholipase Cζ，PLCζ）蛋白缺失使它不足以产生钙离子振荡以激活卵母细胞。受精失败的发生，还可能与精子、卵子自身功能缺陷有关，如精卵膜识别障碍、精卵膜融合缺陷、卵母细胞核成熟度及卵母细胞质缺陷等[21，22]。以上因素就有可能使原核形成失败，从而导致受精失败，与精子形态无显著关系。另外，也可能是由于样本量不足或受其他因素影响，如精子DNA损伤、卵子质量、活性氧水平及不良生活习惯等。

在R-ICSI（PFF）研究中，结果发现NSMR≥4%组受精率大于NSMR＜4%组，两组比较差异有统计学意义（89.77%vs 82.04%）。这可能是因为精子形态正常时，顶体更完整，精子整体质量更好，受精过程更容易发生，受精率提高[23]。有研究[24]指出精子顶体反应是膜融合、水解酶以及基质蛋白释放的生理分泌过程，使精子能够穿透卵子透明带。顶体内含透明质酸酶、顶体蛋白酶等与受精发生相关的水解酶，对精子穿透能力及受精能力有着关键影响作用。肖鑫等[25]探讨精液质量对IVF与R-ICSI两种辅助生殖方式的影响，指出当精子正常形态率＜1.4%，并结合DNA断裂率、顶体完整性及顶体反应率等指标时可优先选择行R-ICSI助孕，相较于IVF具有更好的临床结局。何泳志等[26]研究指出精子顶体完整率高更有益于R-ICSI妊娠结局。顶体是精子的重要组成部分，存在异常形态结构时，易致顶体反应发生障碍而使男性不育，影响精卵相互作用[27]。同时，虽然R-ICSI可人为挑选相对正常形态的精子进行治疗，但仍会不可避免的受到畸形精子的影响，这种“畸形”不仅存在于精子形态上，更体现在人为不能及时评估的“畸形”上，如内部超微结构的损伤、染色体微缺失等，而正是由于精子形态的正常性，使遗传物质及顶体的完整性得以有效保障，降低精卵识别失败率，从而改善了助孕结局。

常规IVF受精失败后行R-ICSI治疗，在生殖临床中已被广泛应用。它不仅给患者再次受精的希望，而且妊娠结局情况更可为生殖医师给患者制定下一周期的诊疗方案提供建设性意见。为探讨R-ICSI临床应用价值，本研究对IVF完全受精失败或部分受精失败两种情况进行分类统计，发现在两种情况下，R-ICSI均可获得不错的妊娠结局，避免IVF周期取消。这与既往学者研究所得结论相一致。如郑娟等[28]学者、Huang B等[29]学者均指出R-ICSI在IVF完全受精失败中具有巨大的临床应用价值，是一种安全的补救方法，临床结局与常规ICSI无明显差异。Cao S等[30]研究发现当IVF受精率小于25%时行R-ICSI更值得推荐。Xiong F等[31]分析比较早期R-ICSI与常规ICSI妊娠结局和新生儿结局，发现并无显著差别，R-ICSI提供了一种安全有效的替代方案。罗平等[32]学者对IVF完全不受精或低受精行早期R-ICSI进行研究，指出补救ICSI在两种情况下，均值得临床应用推荐，是一种较好的补救措施。而本研究在数据更充足的前提下，详细对比分析了多种临床结局指标，在既往研究的基础上更明确了无论在何种情况下（TFF/PFF），补救ICSI均值得推荐使用，可避免无胚胎可移。综上，笔者认为精子正常形态率是评估男性生育力不可忽视的重要因素，可在一定程度上影响早期胚胎发育，R-ICSI是解决IVF受精失败的良策，可优先选择ICSI作为补救方案。