真空冷却联合超声杀菌对卤牛肉品质的影响

高 飞，蔡华珍 ，陈彦豪，杜庆飞，张信东，陈先林，武 运

（1.滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239000；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052；3.天长市厚强家味食品有限公司，安徽天长 239399；4.安徽徽食食品有限公司，安徽滁州 239000）

酱卤肉制品是我国人民喜爱的传统肉制品，在其工业化生产中，绝大多数厂家采用二次高温灭菌的方式来保证产品货架期安全，但高温处理会导致肉质软糜，口感风味与营养均大为降低[1]。因此，降低杀菌温度、保证产品质量和安全成了亟待研究的课题。加工中肉的水分变化既影响感官、质构等食用品质，也影响其货架寿命[2]。肉中水分以自由水、不易流动水、结合水三种状态存在[3]。三种状态水分在加工中会发生迁移，研究其迁移变化，对肉产品深加工具有一定指导意义。酱卤肉制品的品质与安全，与卤制后包装前的冷却温度与时间、二次杀菌程度等关系密切。冷却方面，目前工业生产较普遍采用的是自然冷却、风冷等[4]方式，这种冷却方式下，产品通过20～50 ℃的时间长达3～4 h，20～50 ℃是微生物生长繁殖的适宜温度，不利于产品的保藏[5]；此外，长时间冷却导致生产效率低，成本增加。

真空冷却技术利用真空下食品中的水分从其内部和表面同时蒸发吸热的原理，实现食品本身快速降温[6]，真空冷却比自然冷却速度快20 倍以上，比鼓风冷却快约12 倍[7]，从而快速度过微生物繁殖的危险期并减少热力作用，同时真空冷却处于密闭环境，大大减少了微生物污染[8−9]，确保产品质量。在具体应用上，针对熟肉制品诸如熟制火腿、熟制腊肉、香肠、冷鲜鸡肉等采用真空冷却均取得了较好的冷却效果[4]。在真空冷却的基础上，浸没式真空冷却[10]、鼓泡式真空冷却[11]、超声辅助浸没真空冷却[12]等这种与其他方法联合的真空冷却，在猪肉类熟肉制品的冷却上得到应用，不仅冷却效果好、品质也得到更好提升。在卤牛肉的真空冷却研究方面，蔡华珍等[4]研究了真空冷却协同减菌处理对卤牛肉的保鲜作用，研究发现真空冷却协同减菌处理（未经二次杀菌处理）的卤牛肉货架期达：20 ℃，37 d；4 ℃，164 d，效果很好；周頔等[13]采用真空冷却协同天然保鲜剂处理卤牛肉，亦取得了显著的抑菌效果。

低温杀菌指温度在100 ℃以内可以杀死部分微生物的杀菌方式[14]。超声波处理属于绿色低温杀菌，具有一定的杀菌效果，并能够保存食品原有的感官品质和理化特性[15−16]。超声波杀菌机理主要是功率超声波的空化效应、涡流效应等所产生的瞬间热效应、机械剪切、自由基等对微生物细胞产生破坏，以及超声波导致的细菌周遭环境变化而使细菌产生应激反应，并可能会改变细菌基因的表达，从而抑制或杀死微生物[17−18]。功率超声波的另一个特点是，能够与其他形式的能量协同工作，从而取得更好的效果[19]，Alexandre 等[20]对包装后香肠进行超声波辅助巴氏杀菌，结果显示，与常规处理（82 ℃水浴至香肠中心温度到73 ℃止，约16 min）相比，超声波辅助巴氏杀菌（25 kHz、200 W，74 ℃ 10.53 min）延长保质期达20 d 以上；吴妮等[21]研究得出，热辅助超声波杀菌处理豆腐干的最佳工艺参数为：功率876 W、78 ℃超声处理90 min，认为热辅助超声波处理杀菌效率高、较好地保持了豆腐干的质地和色泽。此外，超声波-微波联合[22]、超声波-微酸电解水联合[23]等等，均有较好的杀菌效果，且对产品品质影响小，但超声波辅助杀菌在酱卤肉制品中的应用尚未见报道。

本实验以挥发性盐基氮（TVB-N）、菌落总数、硫代巴比妥酸值（TBARS）、感官以及水分分布为主要指标，采用单因素实验、对比实验等方法，研究真空冷却与超声波联合处理下卤牛肉的杀菌效果及品质变化，旨在为卤牛肉的工业化安全生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻牛后腿腱子肉 安徽徽食食品有限公司；调味料、香辛料等 当地苏果超市；复合磷酸盐 徐州恒世食品有限公司；亚硝酸钠 四川金山制药有限公司；耐高温蒸煮袋（10 cm×15 cm，双面20 丝） 滁州天宏有限公司；上述材料均为食品级。平板计数琼脂、生物试剂 杭州微生物试剂有限公司；硫代巴比妥酸、氧化镁 国药集团化学试剂有限公司；硼酸、三氯乙酸、乙醇、戊二醛、磷酸氢二钠 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠 西陇化工股份有限公司；盐酸 南京化学试剂有限公司；无特殊说明以上试剂均为分析纯。

DCS-60 熟食品真空急速冷却机 赣州市大昌冷气设备工程有限公司；FRQ-1050ST 非标超声波清洗机 杭州法兰特超声波科技有限公司；DZVACUUM PACKER 真空包装机 青岛艾讯包装设备有限公司；QD-Y10A 臭氧发生器 广州启达环保设备有限公司；SWCJ1D 净化工作台 苏州智净净化设备有限公司；PH-HP290A 恒温恒湿箱 东莞市大华检测设备有限公司；TA.XT-Plus 物性仪 英国Stable Micro System 公 司；MeSONMRI-3060VI 低场核磁 苏州纽迈科技有限公司；JSM-6510LV 型扫描电子显微镜 日本电子株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 参考文献[4]方法制作，略有修改。

工艺流程：原料肉预处理→卤煮→真空冷却→包装→超声杀菌→冷却→检验→成品。

腌制液配方：食盐1.6%，料酒0.6%，糖1.0%，生姜0.6%，复合磷酸盐0.2%，味精0.5%。

操作要点：选取检验合格的冷冻牛后腿腱子肉中段肌肉较多的部位，自来水流水解冻后剔除软骨及表面脂肪、碎肉，洗去血水，分割（约300 g），于浓度8.98 mg/L 的臭氧水中浸泡10 min，再用清水清洗2 遍、沥水，注射腌制液，然后将肉置于盆中，将盆置于片冰上，人工搓揉至腌制液充分吸收，再于4 ℃下腌制18 h，入锅卤煮，卤制条件为100 ℃，5 min，转为98～99 ℃，55 min，然后快速取出置于真空急速冷却机中冷却，冷却至30 ℃时对其喷淋补水，再冷却至终温，取出于洁净环境下真空包装后置于超声池中杀菌，然后水冷至常温，即制得卤牛肉样品。

1.2.2 真空冷却-超声杀菌的条件考察 按照1.2.1方法制作卤牛肉，根据预实验结果及文献报道[4]，设置真空冷却终温12 ℃、真空度1200 Pa，各实验组超声处理肉量：经真空包装的卤肉9 包，每包（200±5）g，将待处理卤肉放入超声波处理槽中，向其加纯水3000 mL，超声波频率为40 kHz，功率分别为1000、1500、2000、2500、3000 W，处理温度60 ℃，处理时间10 min；依据实验得到的最佳功率，处理时间不变，设置超声处理温度分别为50、60、70、80、90 ℃；基于最佳超声杀菌功率和温度，设置超声处理时间分别为10、15、20、25、30 min，制得卤牛肉样品。卤牛肉样品制备后，一部分直接用于测定水分分布并进行感官分析；一部分置于37 ℃培养箱内，2 d 后取样测定挥发性盐基氮（TVB-N）、菌落总数、硫代巴比妥酸值（TBARS），综合分析各条件的杀菌效果和水分分布。

1.2.3 真空冷却-超声杀菌处理对卤牛肉品质的影响按照1.2.1 制作工艺以及1.2.2 最佳超声处理条件制作卤牛肉样品，设为实验组，不超声杀菌的卤牛肉为未杀菌组（除超声外其他处理相同），样品制作后即置于37 ℃培养箱内，2 d 后取样测定菌落总数、TVB-N、TBARS；15’～20’～15’/121 ℃方式进行高温灭菌的样品为高温杀菌组，样品制好后直接测定比较三者的质构、水分分布、微观结构及感官评价。

1.2.4 指标测定方法

1.2.4.1 菌落总数的测定 按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》方法测定。

1.2.4.2 挥发性盐基氮值（TVB-N） 按照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》方法测定。

1.2.4.3 硫代巴比妥酸值（TBARS） 参考文献[20]的方法，并稍作修改。取10 g 卤牛肉样品研细，置于100 mL 具塞三角瓶中，向其加入50 mL 7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1% EDTA），置于摇床振摇30 min，双层滤纸过滤两次，取5 mL 上清液于比色管中，加入0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液5 mL，混匀加塞后90 ℃水浴40 min，冷却至室温后，置于离心机中6500 r/min 离心5 min，取上清液测定532 nm 和600 nm 波长下的吸光度，以空白为对照。测定卤牛肉中的硫代巴比妥酸值，计算公式：

TBARS(mg 丙二醛/kg)=(A532−A600)/155/m×72.06×1000。

式中：A532、A600分别为波长532、600 nm 处的吸光度值；155 为吸光系数；m 为样品质量，g；72.06为丙二醛摩尔质量，g/mol。

以每1000 g 肉中丙二醛的毫克数来表示与2-硫代巴比妥酸反应的物质的量（TBARS）。

1.2.4.4 质构特性分析 采用物性测试仪测定。弹性及内聚性：将加工后的卤牛肉，切成2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm 的小块，采用探头P/36R，测前速度1.00 mm/s，测中速度4.00 mm/s，测试后速度4.00 mm/s，测试间隔时间5.0 s，压缩比30%；硬度及咀嚼性：取加工后的卤牛肉，切成6.0 cm×6.0 cm×3.0 cm 的块状，采用探头为A/MORS 切片型探头，测前速度2.00 mm/s，测中速度2.00 mm/s，测后速度10.00 mm/s，切割厚度5.0 mm。

1.2.4.5 水分分布与核磁成像分析 采用低场核磁测定。样品横向弛豫时间（T2）测定：剔除样品表面筋腱，使其结构一致，称取20 g 样品放入直径25 mm的核磁管中进行检测，测试条件为：共振频率为23.315 MHz，磁体温度为32 ℃，90°脉冲时间P90=22 μs，180°脉冲时间P180=40 μs，采样点数TD=149494，重复扫描次数NS=32 次，回波数NECH=5000，回波时间TE=0.31 ms，使用核磁共振分析软件及CPMG 序列采集牛肉样品T2信号，反演后，对所有数据进行归一化处理。T2分布曲线纵坐标信号强度除以相应样品质量得到归一化T2分布曲线。

H 质子密度成像（MRI）测试：使用核磁成像软件采集卤牛肉矢状面图像。试验参数：使用多层自旋回波序列，主频SF=23.415 MHz，重复时间TR=500 ms，回波时间TE=20 ms，层数8 层，层厚2.0 mm。将成像图处理得伪彩图。

1.2.4.6 电镜扫描分析 样品前处理：参考文献[24]方法，略作修改，采用组织切片用刀片将卤牛肉切成长×宽×厚约8 mm×4 mm×2 mm 的小块，置于2.5%（体积分数）戊二醛溶液中固定24 h 后用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.3）清洗3 次，每次10 min，在27 ℃环境中放置2 h，然后将样品用蒸馏水冲洗，再分别用25%、50%、70%、96%（体积分数）乙醇溶液及无水乙醇梯度脱水2 次，乙醇溶液每次15 min，无水乙醇每次1 h。再冷冻干燥。电镜观察：将冻干卤牛肉块用导电胶带粘到样品处理台上，抽真空后镀上金膜，于扫描电子显微镜上进行扫描。扫描条件：工作电压20 kV，工作距离13 mm，放大倍数100 倍。

1.2.4.7 感官评价 感官评定由感官评定小组在感官评价室完成，感官评价小组由10 位受过培训的人员组成（男女各半），采用双盲法对不同实验组卤牛肉样品进行感官评价。感官评价的指标包括卤牛肉的组织状态、色泽、口感、风味四个方面，每项指标阈值为7（7 分以下即为不可接受），最高分为10 分。感官评分细则见表1。

表1 卤牛肉感官评定标准Table 1 Sensory evaluation criteria of stewed beef

1.3 数据处理

采用SPSS24 统计软件进行方差分析，采用Duncan’s 新复极差法进行多重比较。每个实验均重复三次，数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 真空冷却联合超声处理条件对卤牛肉杀菌的影响

影响超声波杀菌的因素很多，主要是超声波的频率、功率、时间以及微生物的种类、数量和外界环境、介质等，在频率一定的情况下，主要影响因素是超声功率、温度和时间[1]。

2.1.1 超声波功率对卤牛肉杀菌的影响 超声波杀菌与其功率大小密切相关，在较高功率下，超声波对微生物的杀伤率会明显提高[25]。本研究显示（表2），随着超声波功率的增加，杀菌效果明显，卤牛肉的菌落总数、TVB-N 均呈下降趋势，1000 W 组与此后各组相比均呈现极显著差异（P＜0.01），其中，1500、2000、2500 W 三组之间差异显著（P＜0.05），但2500 W以后杀菌效果提高不明显，与3000 W 组间的菌落总数、挥发性盐基氮差异均不显著（P＞0.05），这可能是由于超声功率升至2500 W 时空化作用达到饱和所致[1]。TBARS 反映不饱和脂肪酸的氧化情况，数值越大氧化越严重。本研究发现，超声波功率对TBARS的影响与菌落总数的降低趋势类似。感官方面，各组间无显著差异（P＞0.05）。安全数据和感官评价结果均显示，2500 W 的超声波具有较好的杀菌效果。

肉中水分存在状态与品质有很大关系，水分子的不同存在状态，可以通过低场核磁的横向弛豫时间T2反映。T2越大，水分子自由度越高，反之结合力越强[26]。一般与T2对应的肉中水分有三种存在状态：结合水T21（0～1 ms）、不易流动水T22（1～100 ms）、自由水T23（＞100 ms），P21、P22、P23是与弛豫时间T2对应的三种不同状态水分含量的峰面积[27]。由表2 可知，超声波功率对水分分布影响较大，功率小于2500 W 时，随着功率的增加，结合水（P21）不断增加，不易流动水（P22）呈降低趋势，各功率组间差异显著（P＜0.05）；但当功率大于2500 W 时，各组间P21、P22无显著区别（P＞0.05）；不同功率超声处理对自由水含量（P23）几乎没有影响。结果表明，在一定功率范围内，超声波处理可增加肌肉组织结合水分的能力，这与邹云鹤[28]的研究略有不同，其研究结果显示超声波处理使卤牛肉P22所代表的不易流动水显著高于对照组（P＜0.05），不同功率对其影响不显著（P＞0.05）。分析认为，可能是由于两者超声功率不同所致，邹云鹤采用的功率小于1000 W，而本实验所用功率较大，为1000 W 以上，超声空化对肌纤维破坏较大，可促进肌原纤维蛋白聚集体的破碎[29]，形成小的可溶性蛋白聚集物，同时静电相互作用增强[30]。

表2 超声波处理功率对杀菌效果及水分分布的影响Table 2 Effect of ultrasonic power on sterilization effect and water distribution

2.1.2 处理温度对卤牛肉杀菌的影响 温度协同超声处理可以显著减少微生物数量，提高杀菌效率[28]。由表3 可知，随着杀菌温度的升高，TVB-N、TBARS、菌落总数均呈下降趋势，70 ℃前呈极显著下降（P＜0.01），但高于70 ℃时，除TBARS 外，其他组均无显著差异（P＞0.05），分析认为，可能是由于70 ℃时空化强度达到最大，而超过70 ℃时，其产生的蒸汽压力会降低空化作用[1]，使杀菌效果不明显。此外，超声温度高于70 ℃时，样品组织较为松散、咀嚼性变差，感官分值下降。

表3 处理温度对超声波杀菌效果及水分分布的影响Table 3 Effect of treatment temperature on ultrasonic sterilization effect and water distribution

温度也影响卤牛肉的水分分布，随着温度的升高，P21增加，P22和P23均呈下降趋势，这种趋势在70 ℃前，P21和P22表现显著（P＜0.05），P23在50 和60 ℃下无显著差异（P＞0.05），在60 和70 ℃下显著下降（P＜0.05），70 ℃以后则3 种水分均变化缓慢，无显著差异（P＞0.05）。分析认为，可能是一定温度范围内，温度升高加快促进超声波对肌纤维的断裂作用和分子运动，反应加速，更多小分子物质与水结合，使结合水增加[30−31]；由于肌细胞膜破裂，不易流动水流出而损失，P22减小；70 ℃时超声空化作用达到饱和，继续提高温度，肌原纤维在热效应下破坏程度变大[30]，纤维部分分离，因此自由水流失，P23减小。

2.1.3 处理时间对卤牛肉杀菌的影响 由表4 可知，随着杀菌时间的延长，菌落总数、TVB-N 均呈下降趋势，15 min 内下降迅速，10、15 min 两杀菌组间差异极显著（P＜0.01），但处理时间大于15 min 时，各组间杀菌指标值虽有降低，但变化不显著（P＞0.05），可能是由于超声空化达到了饱和值[1,30−31]。TBARS 值在一定时间内随时间延长呈降低趋势，超声处理10 min 组与其他各组差异极显著（P＜0.01），超声处理15、20 min 组间差异不显著（P＞0.05），但与之后的各组间差异显著（P＜0.05）。感官方面，随着杀菌时间的延长，肉质越来越松软、感官品质下降。本研究综合分析认为，超声波杀菌时间为20 min 时间组的杀菌效果较好。

表4 处理时间对超声波杀菌效果及水分分布的影响Table 4 Effect of treatment time on ultrasonic sterilization effect and water distribution

水分分布上，随着杀菌时间的增加，P21增加，P22与P23呈下降趋势。杀菌15 min 之前，各组间P21、P23差异极显著（P＜0.01），但20 min 组前的各组间P22无显著差异（P＞0.05）；20 min 组（含）之后的时间组间P21呈增大趋势，P22组则呈减小趋势，各组间P23变化无显著差异（P＞0.05）。

上述研究结果均表明，真空冷却-超声波联合处理不仅杀菌效果显著，也在一定程度上降低了氧化作用。不少报道发现超声波有引起蛋白、脂类氧化加速的倾向[32]，但本实验研究显示，超声波杀菌并未引起脂肪氧化增加，相反则是呈降低趋势，造成这种差异的原因可能是，真空冷却处理大大降低了卤牛肉的含氧量；超声杀菌作用在一定程度上降低了微生物引起的脂肪氧化[33]，Alexandre 等[20]研究也发现，超声处理抑制了嗜冷菌和乳酸菌的生长，从而降低了脂质氧化。此外，加工处理方式、原料中脂肪含量及存在形式等不同也可能是造成差异的来源[34]；卤牛肉中成分较为复杂，超声波杀菌的同时，引起美拉德反应产物的增加，这种产物具有一定的抗氧化性[35]，具体原因有待进一步研究证实。

2.2 基于真空冷却的超声杀菌效果比较

2.2.1 杀菌保质效果 由表5 可知，实验组的菌落总数、TVB-N、TBARS 值远低于未杀菌组，差异极显著（P＜0.01）。质构方面，实验组虽略呈降低趋势，但与未杀菌组差异不显著（P＞0.05），感官方面则基本无差异。高温灭菌组的各质构指标、感官指标均最低，与实验组和未杀菌组的差异极显著（P＜0.01），感官主要表现为切片性差、口感软糜。从三者扫描电镜图（图1）上很明显地看出，实验组与未杀菌组结构上差别不大，但与高温灭菌组差别明显。实验组肌纤维细胞膜出现损伤，但肌纤维排列仍较为紧密而规则，未杀菌组的肌纤维排列紧密而规则，肌细胞膜结构完整；而高温灭菌组的结缔组织已经被热力破坏，肌纤维间出现分离，结构松弛，甚至发生断裂游离现象。因此，真空冷却协同超声处理不仅能增加卤牛肉的杀菌保鲜效果，同时也可使卤牛肉具有优良的质地。

表5 超声杀菌效果比较Table 5 Comparison of ultrasonic sterilization effect

图1 不同杀菌处理卤牛肉的微观结构（100×）Fig.1 Microstructure of stewed beef with different sterilization treatments (100×)

2.2.2 水分分布比较 由图2 可知，实验组、未杀菌组、高温灭菌组的横向弛豫时间T2分别是：0.045～133 ms、0.18～166 ms、0.11～297 ms，与未杀菌组相比，实验组弛豫时间T2明显向左偏移，高温灭菌组则向两端扩展，向左稍有偏移，向右扩展极明显，表明超声波杀菌处理大大增加了肉与水的结合力，可能是由于超声波处理增加了蛋白质分子与水分子间相互作用的几率[30,36]，高温处理则增加了卤牛肉中水分的自由度。

图2 不同杀菌处理卤牛肉的低场核磁弛豫时间Fig.2 Low field nuclear magnetic relaxation time of stewed beef with different sterilization treatments

超声处理也导致水分产生了重新分布（表6），与未杀菌组相比，实验组和高温灭菌组的P22减少，P21显著增加，其中，实验组差异达极显著水平（P＜0.01），P23上升亦显著（P＜0.05），分析前已述及，P23的上升可能是由于肌纤维间隙增加，滞留吸附水分增加所致。图3 是卤牛肉二维H 质子密度图像，从图3 可以清楚地看出，实验组的水分含量接近未杀菌组，远高于高温灭菌组，并且水分分布更均匀，Liao 等[12]研究也发现采用超声辅助浸没式真空冷却，可使熟肉制品中水分分布更均匀。

表6 不同杀菌处理的卤牛肉的水分分布Table 6 Water distribution of stewed beef with different sterilization treatments

图3 不同杀菌处理的卤牛肉二维H 质子密度伪彩图Fig.3 Two dimensional H proton density pseudo color map of stewed beef with different sterilization treatments

3 结论

高温处理导致肉质软糜，口感风味与营养均大为降低，已经成为行业痛点。真空冷却可使卤牛肉快速降温，急速通过微生物繁殖的温度危险期，同时真空冷却下环境密闭，不受外界影响、抑制微生物繁殖，从而大大降低超声杀菌卤牛肉的初始菌含量，确保杀菌效果。在真空冷却的前提下，温度协同的超声杀菌效果更好。本实验研究证实了真空冷却-超声处理卤牛肉有很好的杀菌保质效果，超声波功率、温度和时间对杀菌影响较大，超声波功率2500 W、70 ℃，杀菌时间为20 min 时杀菌效果最好，显著降低了菌落总数、TVB-N 和TBARS 值（P＜0.05）。真空制冷-超声杀菌的卤牛肉结构完整、紧实，无软糜现象、口感好；横向弛豫时间T2明显左移，弛豫时间缩短，肉中水与肉成分的结合度增加，分布均匀。因此，真空冷却-超声处理联合对延长卤牛肉产品的货架期、保障产品品质起到很好的作用，对行业生产具有指导意义。