银甲片对盆腔炎性疾病大鼠模型炎性因子及输卵管纤毛形态的影响研究

邓蒂斯，黄叶芳，龚道银

(成都中医药大学附属医院，四川 成都 610075)

盆腔炎性疾病(Pelvic Inflammatory Disease,PID)是女性上生殖道感染引起的一组疾病，包括子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿和盆腔腹膜炎[1]。中医学认为PID属于“妇人腹痛”“带下病”等范畴。文献研究发现[2]输卵管炎会损害正常的输卵管功能，并导致精子受精能力下降，是导致人类和模型动物生育力低下和不孕的主要原因。炎症的刺激会导致输卵管黏膜受损，甚至粘连、堵塞，纤毛也常伴缺损，导致纤毛活动障碍和分泌减少[3]。纤毛粘连导致细胞纤毛运动受阻，影响精子和卵细胞运输及受精过程[4-5]。银甲片是以川派妇科名医王渭川经验方研制而成，现为成都中医药大学附属医院院内制剂。依据川派妇科医家多年临床应用经验，银甲片治疗湿热瘀结型PID临床疗效显著，但具体机制仍不明确。本研究以银甲片降低炎性因子水平及输卵管纤毛形态为切入点，初探银甲片对输卵管炎的治疗作用机制，以期为银甲片治疗输卵管炎提供科学依据。

1 实验材料与设备

1.1 实验动物

7-8周龄SPF级SD雌性大鼠60只，体质量(200±10)g(四川省中医药科学院提供，许可证号：SYXK(川)2013-100)。

1.2 实验药物

妇科千金片(株洲千金药业股份有限公司，规格：0.32 g×18片×6板，生产批号：201510021)；银甲片(成都中医药大学附属医院，川药制字，规格：0.6 g×100片，生产批号：Z20070650)：每片含0.6 g原生药。

1.3 实验试剂

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor α,TNF-α)、超敏C-反应蛋白(High Sensitivity C-reactive Protein,hs-CRP)、白细胞介素6(Interleukin 6,IL-6)、白细胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)Elisa试剂盒(上海茁彩生物，生产批号：ZC-37624，ZC-36450，ZC-36404，ZC-36391)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司，生产批号：K135925C)；PBS(北京中杉金桥生物有限公司，生产批号：ZLI-9062)。

1.4 实验仪器

多管架自动平衡离心机(型号：TDZ5-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；石蜡包埋机(型号：EG1160，德国徕卡仪器有限公司)；石蜡切片机(型号:BM-2135,德国徕卡仪器有限公司)；奥林巴斯光学显微镜(型号：BX41，奥林巴斯株式会社)；自动酶标仪(型号：Infinite M200 pro，瑞士帝肯集团公司)。

2 实验方法

2.1 动物分组

以随机数字表法将正常的SD雌性大鼠以1∶5比例分为空白组和造模组。造模后以随机数字表法将造模成功大鼠等分为5组：模型组、银甲片低剂量组(以下简称低剂量组)、银甲片中剂量组(以下简称中剂量组)、银甲片高剂量组(以下简称高剂量组)、妇科千金片组(以下简称对照组)，加上空白组，共6组，每组8只，共48只大鼠。

2.2 给药方法

2.2.1 造模方法[6]:造模组大鼠腹腔注射1.5 %戊巴比妥纳(40 mg/kg)麻醉后下腹常规消毒，纵向1 cm切口暴露子宫，经子宫以4号针头进针，分别向两侧卵巢方向缓慢注入25 %苯酚胶浆共0.04 mL，分层关腹。术后2只/笼分笼正常饲养，每日消毒护理。造模后无大鼠死亡，其中2只大鼠伤口脓肿。模型判定标准：肉眼见输卵管、卵巢肿大，输卵管、卵巢粘连，病理学结果显示子宫炎细胞浸润，输卵管、卵巢周围淋巴细胞为主的慢性炎细胞增多。

2.2.2 治疗方法：模型组和空白组以10 mL/(kg·d)灌胃蒸馏水；对照组每天以4片/kg即1.28 g/kg(相当于成人等效剂量20倍)脱赋形剂后等体积灌胃妇科千金片(脱赋形剂方法：实验前将药物研磨后溶解于蒸馏水中，置电炉加热至沸腾，冷却后以2 000 r/min(离心半径15 cm)离心5 min，上清液分装，保存备用)。高剂量组以按原生药1.52 g/(kg·d)灌服中药(基于实验动物“体表面积与剂量换算”原则，相当于成人临床剂量20倍)。中剂量组同上法按原生药0.76 g/(kg·d)灌服中药，相当于成人临床剂量10倍；低剂量组同上法按原生药0.38 g/(kg·d)灌服中药，相当于成人临床剂量5倍；1次/d，每日以每100 g大鼠1 mL等体积灌胃，灌胃7 d后停药1 d，7 d为1个周期，共灌胃观察3个周期。

2.3 取材方法

大鼠最后一次给药24 h后，麻醉后股动脉取血，室温下放置1 h，再以2 000 r/min(离心半径15 cm)离心10 min，分离血清后存入-80 ℃备用。麻醉后颈椎脱臼法处死后剖开腹腔，取双侧输卵管、卵巢与子宫，于10 %中性甲醛固定于4 ℃保存。

2.4 检测方法

将处理干净的输卵管、卵巢与子宫经常规脱水、透明石蜡包埋，制作病理切片，HE染色。光镜下观察输卵管、卵巢与子宫形态学改变(由于银甲片中剂量与低剂量组肉眼观测改善不明显，因此仅予高剂量组进行组织形态学观察)。按ELISA试剂盒说明书设定标准孔及测定孔，分批次加入亲和物、底物及终止液，于酶标仪测定OD值，绘制标准曲线计算回归方程后，带入OD值获得样本浓度。

2.5 数据统计分析

3 实验结果

3.1 输卵管、卵巢及子宫肉眼下改变

肉眼观察见：空白组输卵管、卵巢及子宫组织新鲜，均呈淡红色，输卵管呈花环样紧贴卵巢，子宫管径纤细，肌肉丰满。模型组输卵管、卵巢及子宫色泽苍白，输卵管、卵巢肿大，输卵管与卵巢粘连明显，子宫管径增粗。与模型组相比较，高、中剂量组输卵管、卵巢及子宫水肿减轻，减轻程度与剂量相关，高剂量组输卵管、卵巢及子宫呈淡白色，组织肌肉薄，输卵管粘连不明显；中剂量组充血较明显，输卵管与卵巢存在部分粘连；低剂量组改善不明显。与对照组相较，高剂量组卵巢充血、子宫水肿减轻更显著(见图1)。

注：A为空白组，B为模型组，C为高剂量组，D为中剂量组，E为低剂量组，F为对照组

3.2 输卵管、卵巢组织形态学改变

光镜下见：空白组输卵管纤毛清晰、排列整齐，输卵管黏膜层、环纵层肌肉组织清晰，未见炎性细胞浸润，无水肿、充血。模型组输卵管与卵巢纤维结缔组织增生明显，周围淋巴细胞为主的慢性炎细胞增多，组织疏松、水肿，小血管扩张淤血显著；输卵管黏膜皱襞萎缩，纤毛细胞部分倒伏、脱落，肌层肌平滑肌厚薄不一，部分断裂；卵巢组织疏松、水肿明显，髓质内纤维结缔组织及慢性炎细胞明显增多；与模型组相较，高剂量组灶性组织充血、水肿，但输卵管黏膜皱襞萎缩，纤毛细胞倒伏、脱落、肌层平滑肌局灶性厚薄不一、纤维断裂显著减轻，卵巢组织皮髓质分界清楚，髓质纤维组织增生减少，输卵管及卵巢炎性细胞均显著减少。与对照组相较，高剂量组卵巢组织皮髓质分界较清，输卵管纤毛形态恢复更显著(见图2～3)。

注：左侧图HE×100，右侧局部放大图HE×400；A为空白组，B为模型组，C为高剂量组，D为对照组

注：HE×100；A为空白组，B为模型组，C为高剂量组，D为对照组

3.3 子宫组织形态学改变

光镜下见：空白组子宫组织结构清晰，腺体、血管丰富，模型组子宫黏膜组织结构模糊，肌层组织疏松水肿，间质增多，纤维组织增生，大量炎性细胞浸润；与模型组相较，高剂量组黏膜组织纤维化及肌层组织水肿减轻，腺体及血管结构清晰，细胞间质较疏松，炎性细胞显著减少。与对照组相较，高剂量组黏膜组织纤维化、肌层组织水肿程度均更低，腺体及血管结构欠清晰且形态欠佳，炎性细胞减少程度近似(见图4)。

注：HE×100，A为空白组，B为模型组，C为高剂量组，D为对照组

3.4 血清炎性因子

与空白组比较，模型组TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-1β的水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-1β水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图5，表1)。

表1 银甲片对血清炎性因子的影响

注：n=8，与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

4.1 湿热瘀结型PID的中医病因病机

中医学认为：因摄生不慎、房事不洁，或经期、产后、流产后及各种宫腔手术操作后导致脉胞空虚，湿热之邪经阴户侵袭胞宫络脉，留滞体内。且因湿为阴邪，其性重浊趋下，易袭阴位，生殖道位居下焦，最易遭受湿邪侵袭。湿热邪气相搏，郁结不散而化瘀，瘀阻胞宫胞脉，不通则痛，发为盆腔炎。

4.2 银甲片治疗PID的中医学基础

银甲片源自川派妇科名家王渭川经验方，主治湿热瘀结下焦诸证，类如西医诊断之“盆腔炎”“子宫内膜炎”“输卵管不通”等[7]。银甲片药物组成：草红藤、蒲公英、紫花地丁、茵陈、大青叶、蒲黄、鳖甲、琥珀、败酱草、忍冬藤、姜黄、夏枯草、川楝子。方中蒲公英、紫花地丁、草红藤、败酱草、大青叶清热解毒，消肿散结，利尿通淋，凉散风热，效专而力宏；茵陈清热亦可除湿，可用于各种湿疮瘙痒；蒲黄活血化瘀，善治气血不和、瘀血腹疼，姜黄破血行气，通经止痛，两药共奏活血化瘀之功，附以夏枯草散结消肿，川楝子疏肝行气止痛。全方共奏清热利湿化瘀之功，疗效显著。既往临床及实验研究已确定其对慢性盆腔炎性疾病的疗效[8-9]。

4.3 研究结果分析

从组织形态学看，银甲片对输卵管、卵巢及子宫的组织形态恢复存在差异。经银甲片治疗后输卵管纤毛组织水肿、充血显著改善，但纤维化仍存在，输卵管肌层较正常大鼠薄，既往研究认为可能与炎症引起的端粒细胞超微结构损伤相关[10]。纤毛是上皮细胞顶端表面的微管结构，输卵管纤毛结构将影响输卵管液、表皮细胞的运动和细胞信号的传导[11]，正常结构与搏动的输卵管纤毛在拾卵、运卵、为胚胎早起发育提供良好微环境等方面均能产生有利作用[12]。银甲片对输卵管纤毛形态恢复的治疗效果推测这与银甲片软坚散结、活血化瘀之功相关。

高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-1β均显著降低。其中TNF-α、IL-1β、IL-6是研究较为充分的炎性因子，TNF-α是炎症反应中的核心细胞因子，可通过“瀑布效应”加重机体损伤[13]，其诱导的白细胞聚集可阻止炎症弥散并促进组织愈合，但在局部可加重炎症反应诱导瘢痕形成。IL-6是炎症反应的主要标志之一，是导致输卵管慢性炎症、粘连、肉芽纤维组织生长的主要介质[14]。IL-1β可促细胞因子聚集发挥促炎作用[15]。输卵管内含TNF-α、IL-6、IL-1β等多种细胞因子[16]，经上述炎性机制导致输卵管损伤、粘连、炎症瘢痕等形成，输卵管纤毛硬化、缺失。本研究结果显示经银甲片治疗后，PID模型大鼠炎性因子显著下降，炎症反应显著减轻。

综上所述，本研究发现银甲片可通过下调炎性因子水平改善PID炎症反应，并改善大鼠输卵管、卵巢及子宫组织形态学表达，对输卵管纤毛形态的病理改变有较显著优势。