外周血Th17/Treg失衡与卵巢子宫内膜异位囊肿的关系及对其粘连程度的评估价值

成晶晶

子宫内膜异位症（简称内异症）是一种雌激素依赖性的妇科良性疾病，好发于育龄女性，卵巢子宫内膜异位囊肿是最常见的内异症之一[1]。腹腔镜结合病理检查是诊断卵巢子宫内膜异位囊肿和评估其病情的有效手段，然而腹腔镜检查具有创伤性。研究表明，卵巢子宫内膜异位囊肿的本质是一种免疫炎症性疾病，病灶中炎性细胞数量及炎症因子水平均明显升高[2]。进一步研究发现，局部炎性微环境为子宫内膜细胞异位黏附定植和存活提供了有利条件[3]。外周血辅助性T淋巴细胞17（Th17）和调节性T淋巴细胞（Treg）均为介导免疫应答过程的CD4+效应T细胞，而正常机体内促炎性Th17细胞和抗炎性Treg细胞之间处于动态平衡。内异症患者Th17细胞和Treg细胞分泌的细胞因子水平明显异常[4，5]。由此推测，外周血Th17/Treg失衡与卵巢子宫内膜异位囊肿关系密切，然而相关研究较少。由于卵巢子宫内膜异位囊肿病灶周围往往形成粘连，甚至纤维增生，增加手术分离粘连和恢复解剖结构的难度，因此，提高卵巢子宫内膜异位囊肿粘连程度的评估水平，对制定合理的治疗策略十分重要，而外周血Th17/Treg失衡是否与其粘连程度有关仍存在争议。本研究分析外周血Th17/Treg失衡与卵巢子宫内膜异位囊肿的关系及对其粘连程度的评估价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2016年3月～2019年12月在我院接受腹腔镜手术的135例卵巢子宫内膜异位囊肿患者作为研究对象。纳入标准：①20～60岁；②术后病理确诊为卵巢子宫内膜异位囊肿；③有腹腔镜保守手术指征；④知悉研究内容，配合治疗、检查和随访。排除标准：①有盆腹腔手术史者；②处于妊娠期或哺乳期者；③近期接受糖皮质激素或抗炎药物治疗者；④合并免疫性疾病、盆腔炎症性疾病、子宫肌瘤、子宫腺肌病或恶性肿瘤者。

根据美国生殖医学协会子宫内膜异位症分期（r-AFS）评分进行分组[6]：微轻度组（34例，r-AFS评分<16分）和中重度组（101例，r-AFS评分≥16分）。其中微轻度组年龄25～49岁，平均（36.58±5.84）岁；体质指数19～28kg/m2，平均（22.04±1.36）kg/m2；产次0～3次，平均（1.26±0.37）次。中重度组年龄24～55岁，平均（38.12±4.69）岁；体质指数19～27kg/m2，平均（21.98±1.52）kg/m2；产次0～3次，平均（1.35±0.41）次。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 检测方法 采集所有患者术前1d肘静脉血15ml，其中一管10ml血样放置于肝素抗凝管中，严格根据淋巴细胞分离液操作说明书，分离获得外周血单个核细胞，经磷酸盐缓冲液重悬后调节细胞浓度为1×107/ml，提取200μl的外周血单核细胞悬液。检测外周血Th细胞时，向细胞悬液中添加适量的佛波酯、布雷菲德菌素A和伊诺霉素，经孵育、洗涤和重悬后，加入10μl的CD4单克隆抗体，经混匀、孵育、洗涤、固定、破膜，再加入10μl的IL-17A单克隆抗体后，孵育、洗涤并重悬，使用美国BD Biosciences AccuriC6流式细胞仪检测Th细胞比例。检测外周血Treg细胞时，加入CD4和CD25单克隆抗体各10μl，经混匀、孵育、洗涤、固定、破膜后，加入FoxP3+单克隆抗体，孵育、洗涤并重悬，使用流式细胞仪检测Treg细胞比例。另一管5ml血样予以抗凝、离心处理，分离血清，储存于-80℃冰箱中待测，使用酶联免疫吸附试验检测IL-6、IL-17A、IL-10、转化生长因子β（TGF-β）水平，检测结果使用美国伯腾Synergy HT多功能酶标仪读取。

1.3 观察指标 比较两组外周血Th17细胞和Treg细胞比例及Th17/Treg比值、血清IL-6、IL-17A、IL-10、TGF-β水平，分析Th17/Treg比值与r-AFS评分的关系，对比Th17细胞和Treg细胞比例及Th17/Treg比值在不同粘连程度患者中的差异性，其中轻度粘连：病灶周围见透明粘连，无血管生成，可钝性分离；中度粘连：囊肿被粘膜包裹范围小于1/2，粘连致密，需锐性分离；重度粘连：囊肿被粘膜包裹范围不小于1/2，粘连致密，累及周围解剖结构，有血管生成，需锐性分离。通过受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）评价Th17/Treg比值对中重度粘连的预测效能。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据处理，符合正态分布且方差齐性的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验，三组比较采用方差分析；计数资料以率表示，两组比较采用χ2检验；相关性采用Pearson相关分析；采用Delong检验比较两组AUC；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg比值比较 中重度组外周血Th17细胞比例高于微轻度组，Treg细胞比例低于微轻度组，Th17/Treg比值大于微轻度组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组外周血Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg比值比较

2.2 两组血清炎症因子水平比较 中重度组血清IL-6、IL-17A水平高于微轻度组，IL-10、TGF-β水平低于微轻度组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组血清炎症因子水平比较

2.3 外周血Th17/Treg比值与r-AFS评分的相关性 经Pearson相关性分析，卵巢子宫内膜异位囊肿患者外周血Th17/Treg比值与r-AFS评分呈正相关（r=0.265，P=0.013）。见图1。

图1 外周血Th17/Treg比值与r-AFS评分的关系

2.4 外周血Th17/Treg失衡在不同粘连程度患者中的差异 在135例卵巢子宫内膜异位囊肿患者中，存在粘连129例，占95.56%；随着卵巢子宫内膜异位囊肿粘连程度的加重，外周血Th17比例逐渐升高，Treg比例逐渐降低，Th17/Treg比值逐渐增大，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 外周血Th17/Treg失衡在不同粘连程度患者中的差异

2.5 外周血Th17/Treg比值预测中重度粘连的ROC曲线分析 经ROC曲线分析，外周血Th17/Treg比值预测中重度粘连的最佳截断值为4.07，AUC为0.912，明显大于Th17细胞的0.719和Treg细胞的0.685，经Delong检验，差异均有统计学意义（Z=2.826、2.995，P=0.000、0.000）。见图2。

图2 外周血Th17/Treg比值预测中重度粘连的ROC曲线

3 讨论

卵巢子宫内膜异位囊肿为一种低度慢性炎性疾病，具有雌激素依赖和孕激素抵抗的病理特点。免疫清除机制异常，免疫细胞未能识别、清除随逆流经血逸入盆腔的内膜细胞，导致卵巢子宫内膜异位囊肿发病的易感性[7]。研究表明，卵巢子宫内膜异位囊肿的发生、发展均与子宫内膜细胞脱落、异位存活、依附生长等过程有关[8]。卵巢子宫内膜异位囊肿的发病涉及异位种植、侵袭和血管形成等过程，可能是多因素经历多步骤、多阶段共同参与的复杂疾病，与经血逆流、促炎因子分泌、免疫功能抑制等密切相关。研究表明，卵巢子宫内膜异位囊肿患者体内T细胞和B细胞功能异常及数量增多，抗子宫内膜抗体阳性，说明患者的免疫系统出现异常[9]。Th17细胞诱导免疫性、炎症性疾病的发生、发展，而Treg细胞维持机体免疫稳态，促炎性Th17细胞与抗炎性Treg细胞之间平衡失调，是导致卵巢子宫内膜异位囊肿进展的重要因素。

Th17细胞分泌致炎因子IL-6、IL-17A，主导机体防御病原体感染过程，可诱导炎症级联反应[10]。林巧等[11]研究证实，Th17细胞易被促炎因子募集到卵巢子宫内膜异位囊肿处，促进内膜组织增殖，进一步加剧病情。本研究显示，中重度组外周血Th17细胞比例及血清IL-6、IL-17A水平均明显高于微轻度组，与相关研究中卵巢子宫内膜异位囊肿患者外周血促炎性Th17细胞占优势的观点相符[12]，说明此类患者外周循环呈现炎性疾病状态，导致病情持续进展。Treg细胞是一类通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β，发挥免疫抑制功能和维持免疫内环境稳态的辅助性T细胞亚型[13]。章舒等[14]研究显示，卵巢子宫内膜异位囊肿患者外周血Treg细胞分布紊乱，其比例较健康体检者明显降低，使自身免疫反应进一步发生、发展，导致机体对异位内膜细胞的识别、清除能力降低。在本研究中，中重度组外周血Treg细胞比例低于微轻度组，而Treg细胞主要效应分子IL-10、TGF-β水平低于微轻度组，可以推测机体免疫抑制功能减弱，导致异位内膜细胞凋亡异常，造成卵巢子宫内膜异位囊肿的发展。研究表明，卵巢子宫内膜异位囊肿患者外周血存在Th17/Treg平衡紊乱现象，其Th17/Treg比值与痛经程度呈正相关[4]。本研究中重度组Th17/Treg比值大于微轻度组，且外周血Th17/Treg比值与r-AFS评分呈正相关，进一步提示免疫调控紊乱促进病情进展，有可能成为卵巢子宫内膜异位囊肿潜在的治疗靶点。

卵巢子宫内膜异位囊肿粘连的处理较为棘手，术前准确评估粘连程度，可为制订预防、减轻或解决囊肿粘连方法提供依据。本研究显示卵巢子宫内膜异位囊肿患者体内Th17、Treg分布紊乱，其相关细胞因子在血清中表达异常，而外周血Th17/Treg失衡能否用于评价囊肿粘连，尚有待明确。研究指出，在卵巢子宫内膜异位囊肿发生、发展过程中合并免疫调控异常，推测外周血Th17/Treg失衡与囊肿粘连有关[15]。本研究中囊肿粘连发生率为95.56%，与既往文献报道相符[16]，提示卵巢子宫内膜异位囊肿患者发生粘连的风险较大；与此同时，随着卵巢子宫内膜异位囊肿粘连程度的加重，外周血Th17比例逐渐升高，Treg比例逐渐降低，Th17/Treg比值逐渐增大，提示中重度粘连卵巢子宫内膜异位囊肿患者外周血Th17/Treg失衡更显著。杨娟等[17]研究表明，Th17/Treg失衡引起炎症反应是导致卵巢子宫内膜异位囊肿组织粘连、纤维增生的重要因素，与本研究相符。外周血Th17/Treg比值增大，可能提示卵巢子宫内膜异位囊肿患者存在严重粘连。本研究ROC曲线分析显示，外周血Th17/Treg比值可协助判断卵巢子宫内膜异位囊肿粘连程度，对疑似存在中重度囊肿粘连的患者，术前及术后均应接受促性腺激素释放激素激动剂治疗，在首选微创手术的同时，术中需谨慎止血，合理使用防粘连制剂，以增加患者的临床获益。但外周血Th17/Treg失衡是否导致卵巢子宫内膜异位囊肿患者发生粘连的风险增加，仍有待进一步研究。

综上所述，外周血Th17/Treg失衡可能与卵巢子宫内膜异位囊肿的严重程度密切相关，检测Th17/Treg比值预测中重度粘连的效能较好，可能成为早期评估病情的理想指标。但本研究样本量较少、随访时间较短，未能分析外周血Th17/Treg失衡与术后复发的关系，将在后续研究中进一步完善。对外周血Th17/Treg失衡患者进行免疫调节，深入分析外周血Th17/Treg失衡在卵巢子宫内膜异位囊肿发生、发展中的作用机制，可能是未来研究的热点。