平喘止咳方治疗慢性阻塞性肺疾病的网络药理学与分子对接研究*

黄柏文，朱宇敏，胡 珀，祝 颖，李 萍

（1. 江苏省南京市中西医结合医院呼吸科，江苏 南京 210014； 2. 南通大学附属医院中医科，江苏 南通 226000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的主要特征为持续的呼吸道症状及不完全可逆的气流受限［1］，其患病率随年龄的增长而升高［2］。西药对症治疗COPD 起效较快，但停药后易复发，且副作用大，严重影响患者的生存质量。中医辨证施治可提高患者的免疫力，改善肺通气，并可辅助西药治疗，达到减毒增效目的［3-4］。平喘止咳方由桑叶、黄芩、百部等中药组方，具有清肺平喘、止咳化痰功效。在常规西药治疗基础上应用平喘止咳方，可有效改善患者的膈肌功能，缓解呼吸肌疲劳，进而提高COPD 的疗效［5］。网络药理学具有多成分、多靶点及多通路的特点，与中医药整体观、辨证论治的原则相符［6］。本研究中基于网络药理学和分子对接技术，通过构建中药复方调控网络，系统分析并预测平喘止咳方治疗COPD 的活性成分、作用靶点及相关通路，探讨药物与机体的相互作用，揭示其潜在作用机制，为平喘止咳方的临床研究提供理论基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料

本研究中所用数据库信息见表1。

表1 数据库信息Tab.1 Information of databases

1.2 方法

平喘止咳方的相关成分及靶点获取：通过TCMSP数据库，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18［7］为筛选条件，检索平喘止咳方中桑叶、黄芩、百部、北沙参、陈皮、紫菀、款冬花、麻黄、桔梗、半夏、苦杏仁、木香、甘草的活性成分及作用靶点，借助Uniprot数据库对作用靶点进行标准化处理。

COPD 靶点筛选：以“Chronic obstructive pulmonary disease”为关键词，在GeneCards，OMIM，DisGeNET 数据库中分别检索COPD 的潜在靶点，合并各个数据库的靶点，并删除重复项，即得疾病相关靶点。

平喘止咳方治疗COPD 靶点筛选：将上述COPD靶点及平喘止咳方靶点导入Venn 2.0.2数据库，进行匹配映射，获取平喘止咳方和COPD 的共有靶点，即平喘止咳方治疗COPD的靶点。

活性成分- 共有靶点网络构建：将上述平喘止咳方的活性成分与共有靶点导入Cytoscape 3.8.0 软件中，构建平喘止咳方活性成分-共有靶点网络，并进行网络拓扑参数分析，最后通过度值筛选核心成分。度值越大，该成分在治疗COPD过程中越关键。

治疗COPD 核心靶点的网络构建及网络拓扑学分析：将平喘止咳方活性成分与COPD 的共有靶点输入String 数据库，物种设置为“智人”种，最小交互分值设为0.7，构建蛋白互作网络（PPI），再将结果以“TSV”格式导入Cytoscape 3.8.0 软件中进行网络拓扑参数分析，度值排名靠前的共有靶点即为核心靶点［8］。

共有靶点GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析：将平喘止咳方活性成分与COPD 的共有靶点导入DAVID 数据库，物种设置为“智人”种，选择GO 功能富集分析项下的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）三部分及KEGG 通路部分进行富集分析。设定P＜0.05为富集分析结果显著，采用R 语言选择排序靠前的结果作图分析。

分子对接验证：采用Autodock Vina 软件对核心成分与核心靶点进行分子对接，借助Pymol 软件作图。以最低结合能评价结合分子对接的好坏，结合能越低，表明对接结果越好。本研究中以结合能≤-5 kJ/mol 为相互作用较好［9］。

2 结果

2.1 平喘止咳方的活性成分靶点

在TCMSP数据库中，共筛选OB ≥30%和DL ≥0.18的活性成分253个，其中甘草92个，黄芩36个，桔梗7 个，苦杏仁19 个，款冬花22 个，麻黄23 个，木香6 个，桑叶29 个，紫菀19 个，删除重复项后得到216 个活性成分。得到相关成分靶点5 895 个，借助Uniprot 数据库进行校正，删除重复项后得到286个活性成分靶点。

2.2 平喘止咳方治疗COPD 的靶点

从GeneCards，OMIM，DisGeNET数据库中分别得到COPD靶点478个、147个、23个，删除重复项后得到586个COPD靶点。与2.1项下活性成分靶点取交集，得到89个共有靶点，即为平喘止咳方治疗COPD 的靶点。详见图1。

图1 平喘止咳方活性成分靶点与COPD靶点的维恩图Fig.1 Venn diagram of the targets of active components in Pingchuan Zhike Decoction and targets of COPD

2.3 平喘止咳方的活性成分-共有靶点网络

将得到的216 个活性成分与89 个共有靶点导入Cytoscape 软件中，构建平喘止咳方活性成分- 共有靶点网络，详见图2。网络中有284 个节点，1 039 条边。根据度值筛选得到槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-胡萝卜素、汉黄芩素、黄芩素等核心成分。

图2 平喘止咳方活性成分-共有靶点网络图Fig.2 Network diagram of active components - common targets

2.4 治疗COPD 核心靶点的PPI

将平喘止咳方与COPD 的共有靶点导入String数据库中，获得PPI，详见图3。并采用Cytoscape 3.8.0 软件进行分析，根据度值进行筛选，得到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白细胞介素6（IL-6）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）、水孔蛋白5（AQP5）、解整合素金属蛋白酶8（ADAM8）、黏蛋白5AC（MUC5AC）等核心靶点。

图3 治疗COPD核心靶点的PPIFig.3 PPI of core targets in the treatment of COPD

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析结果显示，得到生物过程2 132条，主要涉及对脂多糖、对细菌来源分子的反应，以及细胞对化学应激的反应等；得到细胞组成84条，包括膜筏、膜微区、膜区等；得到分子功能143 条，包括内肽酶活性、蛋白磷酸酶结合、丝氨酸型肽酶活性等。根据P值分别选取GO 功能富集分析条目排名前10 的结果绘制条形图，详见图4。KEGG 通路富集分析得到155 条信号通路，主要涉及磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT、肿瘤坏死因子（TNF）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、白细胞介素17（IL-17）、缺氧诱导因子1（HIF-1）等，根据P值选取排名前20的结果绘制气泡图，详见图5。

图4 GO功能富集分析条形图Fig.4 Bar chart of GO function enrichment analysis

图5 KEGG通路富集分析气泡图Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接验证

采用Autoduck Vina 软件进行分子对接验证，结果核心成分和核心靶点对接能量全部＜-5 kJ/mol，对接结果良好，验证了网络药理学预测的准确性（图6 A）。对接结果显示，STAT3 和quercetin、AQP5 和kaempferol 的对接能量最小，其结合模式见图6 B和图6 C。

3 讨论

COPD 属中医“肺胀”“喘证”范畴，本虚标实是其主要病理机制，以肺、肾、心、脾脏气亏虚为本，痰浊、水饮、血瘀互结为标，治宜扶正与祛邪兼顾［10］。平喘止咳方由桑叶、黄芩、百部等中药组方，具有化痰、理气、通气功效。临床研究表明，该方治疗COPD 急性加重期92例，有效率为93.48%，可提高COPD 患者的肺功能及血气指标水平［5］。但中药成分的复杂性，其治疗COPD 的分子机制尚不明确。

本研究中通过网络药理学方法对平喘止咳方治疗COPD 的作用机制进行了较全面地分析。活性成分-共有靶点网络分析发现，槲皮素、山柰酚、木犀草素等为核心成分。魏萍等［11］研究发现，槲皮素能降低转化生长因子β1（TGF - β1）、α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）、TNF-α 等的表达水平，缓解大鼠的肺组织炎症和纤维化损伤。山柰酚可降低炎性因子TNF - α 等的表达水平，减少炎性细胞聚集，抑制炎性反应［12］。木犀草素具有抗纤维化、抑制炎性反应、调节免疫等作用，可显著降低COPD 患者体内血清TNF-α 水平，使肺功能指标如最大通气量、呼气峰流速等得到明显改善［13］。

A. 核心成分与核心靶点分子对接热图 B.STAT3和quercetin对接模式图 C.AQP5和kaempferol对接模式图图6 分子对接图A.Heat map of molecular docking of core components and core targets B.Docking mode diagram of STAT3 and quercetin C.Docking mode diagram of AQP5 and kaempferolFig.6 Diagrams of molecular docking

PPI 及KEGG 通路富集分析发现，AKT1，IL - 6，STAT3，AQP5，ADAM8，MUC5AC为核心靶点，主要调控PI3K/AKT，TNF，MAPK，IL - 17，HIF - 1 等信号通路，从而发挥治疗COPD 的作用。AKT 可由活化的PI3K 募集而活化，进而广泛参与细胞自噬、增殖、凋亡等生物调控［14］。通过下调PI3K 和AKT1 基因表达、上调mTOR基因表达，减轻COPD 模型大鼠肺组织炎性细胞的浸润及纤维组织增生，从而缓解肺组织损伤，起到抗COPD的 作 用［15］。PI3K/ AKT/ 哺 乳 动 物 雷 帕 素 靶 蛋 白（mTOR）通路为细胞内的基本信号转导途径，上调PI3K/ AKT/ mTOR 的表达可使呼吸道平滑肌细胞增殖、迁移及黏附，并使细胞外基质成分积累，导致气道壁增厚而发生COPD［16］。MAPK是细胞中的一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要包括胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun 氨基端蛋白激酶（JNK）、p38。当JNK 及p38 被激活时，可修复气道上皮细胞及促进黏蛋白MUC5AC 的表达［17］。STAT为JAK激酶（JAK）的下游基因，共同组成的JAK/ STAT 信号通路在细胞增殖及凋亡中至关重要。通过促进JAK，STAT3 等磷酸化，进而上调JAK/STAT 的表达，可引发炎性反应，促进COPD 肺血管重塑［18］。辅助性T 细胞17（Th17）及其特异性细胞因子参与介导COPD产生及进展过程中的多个环节，尤以IL-6，IL-17A，TNF-α 等对肺局部的炎症、自噬、纤维化等发挥重要作用，因IL - 6，IL - 17A，TNF - α 等各类特异性细胞因子的异常高表达而推进了COPD 的进程［19］。HIF-1α 可上调一氧化氮合酶基因，参与肺血管的重塑，进一步参与COPD 的发生与发展［20］。本研究结果表明，平喘止咳方可能通过槲皮素、山柰酚、木犀草素等主要活性成分作用于AKT1，IL- 6，STAT3 等相关靶点，从而调控PI3K/AKT，TNF，MAPK 等信号通路而发挥治疗COPD的作用。

综上所述，本研究中采用网络药理学和分子对接技术初步揭示了平喘止咳方通过多成分、多靶点、多通路治疗COPD 的分子机制。但因数据库更新不及时、收录不全等原因，仅单纯通过数据库及网络模型预测，无法完全评价平喘止咳方在体内的具体代谢过程，需后续实验进一步验证。