两种布洛芬共晶与牛血清白蛋白作用机制研究*

范 莹，张帅华，杨 钊

（1. 中国人民解放军海军青岛特勤疗养中心，山东 青岛 266071； 2. 山东大学药学院，山东 济南 250012；

3. 山东省青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071）

大多数药物通过静电作用、氢键及范德华力等非共价相互作用与血浆蛋白可逆地结合，随血液运送至机体各个部位，转化为游离态后发挥作用。白蛋白是血浆中重要的药物结合蛋白，丰度最高，相对分子质量较小［1-3］，不仅可影响药物在体内的转运、分布和代谢［4］，还能解毒，影响药效发挥［5］。因此，研究药物与蛋白质的相互作用，有助于阐明药物的体内过程及作用机制［6-7］。布洛芬是临床常用非甾体解热镇痛抗炎药，水溶性差，生物利用度不高。布洛芬- 异烟酰胺（IBU -INA）和布洛芬-2-吡啶甲酰胺（IBU-2PA）共晶［8］可提高其水溶性，但2 种共晶如何与蛋白质结合，是否会影响布洛芬与血浆蛋白的相互作用，进而影响药效的发挥，尚无系统研究。本研究中采用荧光光谱法和紫外吸收光谱法探讨了2 种布洛芬共晶与白蛋白的相互作用机制。由于牛血清白蛋白（BSA）与人血清白蛋白（HSA）具有相似的结构和相近的相对分子质量［9］，且价格低廉、易获得，故本研究中以BSA 替代HSA［10］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV2600 型紫外分光光度计（日本岛津公司）；F-4500型荧光光谱仪（日本日立公司）；DK-S24型数显恒温水浴锅（上海柏欣仪器设备厂）；微量移液枪（德国Brand 公司）；BT125D 型电子天平（德国Sartorius 公司，精度为万分之一）。

1.2 试药

布洛芬原料药（山东新华制药股份有限公司）；异烟酰胺对照品（批号为FGE01AHFI），2 - 吡啶甲酰胺（批号为LU90S100），纯度均为99.8%，购于北京百灵威科技有限公司；BSA（相对分子质量为68 000，蛋白质≥95%，北京索莱宝科技有限公司，批号为929F052）；甲醇、乙腈，均为色谱纯，购于德国默克公司。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 溶液制备

BSA 溶液：取BSA 68 mg，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加入适量蒸馏水溶解并定容，精密量取上述溶液

12.5 mL，置50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，即得。

布洛芬、共晶溶液：分别取10 mg 布洛芬、相当摩尔量的布洛芬共晶（IBU-INA 和IBU-2PA），精密称定，分别溶于10 mL甲醇中，即得。

2.1.2 光谱测定

精密量取BSA 溶液3 mL，共7 份，以5 μL 梯度从0开始分别加入布洛芬溶液（猝灭剂），试验温度下水浴恒温30 min。于285 nm 检测波长处，激发和发射狭缝宽度为4 nm 条件下扫描290～450 nm 波长范围BSA 在布洛芬作用下的荧光猝灭光谱［11］。同法，测定加入以2 种布洛芬共晶为猝灭剂时BSA的荧光猝灭光谱。

取2.1.1 项下布洛芬及其2 种共晶溶液，分别稀释1 000 倍，测定290～450 nm 波长范围的紫外吸收光谱，并扫描同波长范围BSA 溶液的荧光光谱，以及BSA 与药物摩尔比为1∶1时BSA的荧光光谱。

2.2 结果

2.2.1 荧光猝灭光谱

不同试验温度下，在BSA 溶液中加入不同量的布洛芬及其2 种共晶后，BSA 荧光猝灭光谱见图1。结果表明，随着猝灭剂加入量的增多，BSA 的荧光强度不断减弱，说明药物及其共晶均与BSA 发生了相互作用，而荧光光谱的峰位却无明显变化，提示布洛芬及其2 种共晶可能未改变荧光发色团的极性。

2.2.2 荧光猝灭类型

荧光猝灭根据猝灭机制的不同可分为静态猝灭和动态猝灭［12］，根据常用猝灭常数随温度的变化趋势来判断猝灭类型［13-15］。无论静态猝灭还是动态猝灭均遵循Stern-Volmer方程。见公式（1）。

式中，F0为纯BSA 溶液的荧光强度，F为加入猝灭剂后BSA 溶液的荧光强度，Kq为猝灭常数，τ0为生物大分子内源性荧光寿命，约为10-8s，［Q］为猝灭剂（加入药物）的浓度，Ksv为Stern-Volmer猝灭常数［16-20］。

A1，A2. 布洛芬（32，40 ℃） B1，B2.IBU-INA（32，40 ℃） C1，C2.IBU-2PA（32，40 ℃）图1 布洛芬及其共晶在不同温度下BSA的荧光猝灭光谱Note：Curves 1 to 7 indicate that the volume of quencher added increases in a gradient of 5 μL.A1，A2.Ibuprofen（32，40 ℃） B1，B2.IBU-INA（32，40 ℃） C1，C2.IBU-2PA（32，40 ℃）Fig.1 Fluorescence quenching spectra of ibuprofen and ibuprofen co -crystals interacted with BSA at different temperatures

A. 布洛芬与BSA B.IBU-INA与BSA C.IBU-2PA与BSA图2 不同温度下布洛芬及其共晶与BSA相互作用的Stern-Volmer曲线A.Ibuprofen and BSA B.IBU-INA and BSA C.IBU-2PA and BSAFig.2 Stern-Volmer curves of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA at different temperatures

不同试验温度下，布洛芬及其共晶与BSA相互作用的Stern-Volmer曲线见图2。拟合得到的Stern-Volmer方程和参数见表1。可知，温度升高，猝灭常数Ksv减小，32 ℃和40 ℃温度条件下的Kq值均明显大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数2.0×1010L/（mol·s），这与静态猝灭的特征一致［21-22］，提示布洛芬在形成共晶后仍具有与血浆蛋白结合形成复合物的能力。

表1 布洛芬及其共晶与BSA相互作用的Stern-Volmer方程及速率常数Tab.1 Stern-Vlomer equations and rate constants of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA

2.2.3 表观结合常数

对于静态猝灭过程，可由修正的Stern - Volmer 方程求出其结合反应的结合常数［23］，用以判断药物分子与蛋白质的亲和能力。见公式（2）。

式中，F0为BSA 溶液的荧光强度，F为加猝灭剂后BSA 的荧光强度，KA为表观结合常数，n为结合位点数，［Q］为药物浓度。以lg［Q］为横坐标、lg［（F0-F）/F］为纵坐标作图（图3），根据以上修正方程拟合得到的线性方程和参数见表2。可知，随着试验温度的升高，表观结合常数呈下降趋势。这是由于猝灭剂与BSA 的结合具有可逆性，随着温度的升高，两者间的结合力逐渐减弱，猝灭剂-BSA复合物的稳定性也不断降低，符合静态猝灭特征。32 ℃时，布洛芬与BSA 的结合常数为1 545 L/mol，2 种共晶IBU-INA 和IBU- 2PA 与BSA 的结合常数分别为2 074 L/mol 和1 303 L/mol。提示2 种布洛芬共晶与BSA均具有较强的结合能力。

表2 布洛芬及其共晶与BSA相互作用的表观结合常数Tab.2 Apparent binding constants of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA

2.2.4 作用力类型

根据反应前后热力学吉布斯自由能变化（ΔG）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）阐明药物与BSA 的主要相互作用力类型至关重要。当ΔH＞0，ΔS＞0时为疏水作用力；当ΔH＜0，ΔS＜0 时为氢键和范德华力；当ΔH＜0，ΔS＞0时为静电引力。当温度变化不大时，焓变ΔH可看作常数，根据公式（3）、公式（4）、公式（5）［24］分别求出ΔG，ΔH，ΔS，结果见表3。

表3 布洛芬及其2种共晶与BSA相互作用的热力学参数Tab.3 Thermodynamic parameters of ibuprofen and two ibuprofen co-crystals interacted with BSA

A. 布洛芬与BSA B.IBU - INA与BSA C.IBU - 2PA与BSA图3 布洛芬及其共晶与BSA相互作用修正的Stern-Volmer曲线A.Ibuprofen and BSA B.IBU-INA and BSA C.IBU-2PA and BSAFig.3 Modified Stern-Volmer curves of ibuprofen and ibuprofen co-crystals interacted with BSA

式中，R为气体常数，T，T1，T2均为温度，KA，K1，K2均为结合常数。

结果显示，当试验温度为32 ℃和40 ℃时，ΔH和ΔS均小于0。因此，在布洛芬及其共晶与BSA 的相互作用中，氢键和范德华力可能起了主要作用。ΔG小于0，有利于反应的自发进行，说明药物与BSA 的结合是自发进行的。

2.2.5 结合距离

根据Föster 提出的荧光共振能量转移（FRET）理论，可计算出药物与生物大分子之间的距离。FRET 程度与供、受体分子的空间距离密切相关，一般空间距离≤7 nm 时即可发生FRET，随着距离的增大，FRET 呈现明显减弱趋势［25］。FRET 的转移效率与供体-受体间结合距离r和临界能量转移距离R0的关系见公式（6）。

式中，F0为BSA 溶液的荧光强度，F为加入猝灭剂时BSA的荧光强度。R0可由公式（7）求出。

式中，K2为偶极空间取向因子，N为介质的折射常数，Ф为荧光量子产率，J为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分面积J（λ）可由公式（8）求出。

式中，F（λ）为给体的荧光强度，ε（λ）为受体摩尔消光系数。

BSA 的荧光发射光谱和布洛芬及其2 种共晶的紫外吸收光谱见图4，计算得到R0和r，结果见表4。其中，布洛芬与BSA 结合距离r为1.19 nm，2 种共晶IBU -INA 和IBU-2PA 与BSA 的结合距离分别为1.22 nm 和1.31 nm，均小于7 nm，这说明布洛芬及其共晶与BSA作用时发生了非辐射能量转移。

表4 布洛芬及其2种共晶与BSA相互作用时能量转移参数Tab.4 Energy transfer parameters of ibuprofen and two ibuprofen co-crystals interacted with BSA

3 讨论

本课题组前期研究发现，制备的2种布洛芬共晶可提高布洛芬的水溶性，而药物发挥作用还需通过与血浆蛋白结合，由血液运输到全身各处靶细胞来实现，故本研究中采用荧光光谱法和紫外吸收光谱法对2 种布洛芬共晶与血浆蛋白的相互作用机制进行了初步探讨。

A. 布洛芬 B.IBU - INA C.IBU - 2PA图4 BSA的荧光发射光谱和布洛芬及其共晶的紫外吸收光谱A.Ibuprofen B.IBU-INA C.IBU-2PAFig.4 Fluorescence emission spectrum of BSA，ultraviolet absorption spectrum of ibuprofen and ibuprofen co -crystals

蛋白质中的芳香族氨基酸残基的侧链基团可吸收紫外区域的入射光，从而发射荧光特性。而药物共晶作为荧光猝灭剂，可减弱蛋白质的荧光强度。因此，根据梯度体积的布洛芬共晶溶液对BSA 荧光强度的猝灭作用及不同温度下猝灭效果的变化，发现布洛芬共晶可与血浆蛋白相结合。本研究结果显示，随着药物共晶加入量的增多，BSA 的荧光强度呈现减弱趋势，提示布洛芬形成共晶后依然可使BSA 发生荧光猝灭，不影响布洛芬与BSA 的结合。升高温度会减弱荧光猝灭效果，说明此过程为静态猝灭。在药物共晶与蛋白质分子相互作用中，主要作用力为氢键和范德华力，结合常数的数据表明共晶与BSA 的结合能力较强，其结合距离r均小于7 nm，提示两者相互作用时能量发生了转移。药物与血浆蛋白的结合能力是影响药物体内过程的重要因素，本研究中布洛芬形成共晶后不会改变布洛芬与血浆蛋白的作用和结合能力，这为今后研究共晶在生物体内的药代动力学过程提供了依据，对共晶技术在新药研发中的应用具有积极意义。