正交试验法优选抗早颗粒提取及成型工艺*

钱 芳，陈 煜

（江苏省中医院药学部，江苏 南京 210029）

性早熟为生长发育异常疾病，严重威胁儿童的身心健康，影响儿童的身体发育。抗早颗粒为我院儿科的临床经验方，由黄柏、知母、枳壳、陈皮等中药组方，具有健脾化痰、滋阴降火之功效，用于痰火互结型性早熟。临床应用以汤剂为主，疗效确切，但服用、携带、贮存均不方便。中药颗粒剂服用、携带、贮藏均较方便，吸收较快，产品质量稳定，适用于工业化生产，故拟将汤剂开发成颗粒剂。本研究中以盐酸小檗碱含量和干膏率的综合评分为指标，通过正交试验优选抗早颗粒的提取工艺；以颗粒得率和水分为指标，在单因素考察基础上，通过正交试验优选抗早颗粒的成型工艺，为医院制剂的规范化生产和后期的药学试验奠定基础，以确保临床用药安全有效。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100 型液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有G1322A 型脱气机，G1311A 型四元泵，G1316A 型柱温箱，G1314A 型VWD 检测器，Agilent ChemStation 工作站；BP - 211D 型电子分析天平（德国Sartorius 公司，精度为十万分之一）；WBF - Ⅱ型多功能流化床实验机（重庆英格造粒包衣技术有限公司）；SH10A 型快速水分测定仪（上海精科实业有限公司）；PL-S40T 型超声波清洗机（东莞康士洁超声波科技有限公司，功率为240 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110713 - 201212，纯度为86.7%）；黄柏（批号为20191002），知母（批号为19012603），枳壳（批号为191202），陈皮（批号为19120806），夏枯草（批号为200101），均购于安徽协和成药业饮片有限公司；糊精（安徽山河药用辅料公司，批号为200310）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司，批号为1758107446）。

2 方法与结果

2.1 君药黄柏中盐酸小檗碱含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈- 0.1%磷酸溶液（45∶55，V/V），每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g；检测波长：265 nm［1］；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，按此色谱条件进样测定。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同位置有相应色谱峰，且阴性对照无干扰，盐酸小檗碱峰分离度大于1.5。

2.1.2 溶液制备

取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加流动相制成每1 mL含盐酸小檗碱452.23 μg的溶液，以流动相稀释至质量浓度为13.567 μg/ mL 的溶液，即得对照品溶液。称取处方量饮片88 g，加10 倍量水，煎煮2 次，每次40 min，滤过，合并2 次滤液，浓缩至150 mL，即得样品贮备液；精密吸取此样品贮备液5 mL，置25 mL 容量瓶中，加流动相，超声处理（功率为240 W，频率为40 kHz）20 min，放冷，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。同法制备缺黄柏的阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察与与检测限、定量限确定：精密吸取上述对照品溶液（质量浓度13.567 μg/ mL）3，5，10，20，30，40，50 μL，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y= 3 979.1X- 0.920 2，r= 1.000 0（n= 7）。结果表明，盐酸小檗碱进样量在0.040 7～0.678 4 μg 范围内与峰面积积分值线性关系良好。取2.1.2项下对照品溶液，加流动相稀释，得质量浓度分别为9.04，4.52，0.90，0.45，0.22，0.11 μg/mL的系列溶液，测定基线噪音。分别按信噪比（S/N）3∶1和10∶1 时的质量浓度计算检测限和定量限。结果盐酸小檗碱的检测限和定量限分别为0.11 μg/ mL 和0.45 μg/mL。

精密度试验：精密吸取2.1.2 项下对照品溶液（质量浓度为13.567 μg/ mL）10 μL，按2.1.1 项下色谱条件，日内连续进样6 次，计算峰面积，日内精密度的RSD为0.50%（n=6）；连续进样6 d，计算峰面积，日间精密度的RSD为0.95%（n= 6）。结果表明，仪器精密度良好。

重复性试验：精密吸取2.1.2 项下样品贮备液5 mL，共6 份，依法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定。以盐酸小檗碱含量计算，结果的RSD为1.61%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.1.2 项下样品贮备液适量，按2.1.1项下色谱条件分别于0，2，4，6，8，12 h 时进样测定。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.78%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验：取2.1.2项下样品贮备液2.5 mL，共6 份，分别加入盐酸小檗碱对照品溶液（质量浓度为452.23 μg/ mL），依法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果平均回收率为98.06%，RSD为0.56%（n=6）。

2.2 水提工艺研究

2.2.1 干膏得率

精密吸取2.1.2 项下样品贮备液2 mL，蒸干，105 ℃干燥3 h，放入干燥器冷却30 min，称定质量。干膏得率（%）=（W×V1）/（W1×V2）× 100%。式中，W为干膏质量，V1为浓缩液总体积，W1为药材总质量，V2为取样体积。

2.2.2 正交试验设计

根据预试验，取处方量饮片，采用L9（34）正交试验，对提取时间（因素A）、提取次数（因素B）、加水量（因素C）进行考察。因素与水平见表1。

表1 水提工艺因素与水平Tab.1 Factors and levels of water extraction process

2.2.3 正交试验结果与分析

取处方量饮片，以L9（34）正交试验表安排试验，以干膏得率（a）和盐酸小檗碱含量（b）为评价指标，采用加权评分法计算综合评分，权重系数分别为0.3和0.7。综合评分=（a/amax）×30+（b/bmax）×70，以此评分作为筛选指标。采用SPSS 17.0 统计学软件进行分析，结果见表2至表3。

表2 水提工艺正交试验设计与结果Tab.2 Design and results of the orthogonal test of water extraction process

表3 水提工艺方差分析结果Tab.3 Results of ANOVA of the water extraction process

由表3 可知，因素A、因素C 对试验结果无显著影响，因素B 对试验结果有显著影响，影响由大到小为B ＞A ＞C；由表2 可知，不同水平影响由大到小为A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2。由此，确定最佳水提工艺为A2B3C1。综合考虑降低生产成本和缩短生产周期等，优选水提工艺为A2B2C1，即加8 倍量水，提取2次，每次40 min。

2.2.4 验证试验

取3 份处方量饮片，按优选工艺提取。由表4 可知，优选的工艺可行。

表4 水提工艺验证试验结果Tab.4 Results of the validation test of water extraction process

2.3 成型工艺优选

2.3.1 颗粒得率

称定制得颗粒的质量，收集能通过1号筛但不能通过5 号筛［2］的颗粒。颗粒得率（%）= 过筛后颗粒质量/过筛前颗粒质量×100%。

2.3.2 颗粒水分

取颗粒5 g，精密称定，置快速水分测定仪测定，读数。

2.3.3 单因素考察

浸膏相对密度：称取糊精，置流化床制粒机底部，按2.2.3项下优选水提工艺提取，浓缩所得浸膏调成相对密度分别为1.10，1.15，1.20（60 ℃），调节喷雾速率、雾化压力、物料温度等，使物料保持沸腾。结果浸膏相对密度为1.15（60 ℃）时制得颗粒质量较好。详见表5。

喷雾速率：称取糊精，置流化床制粒机底部，将浸膏调成相对密度为1.15（60 ℃），调节喷雾速率分别为10，20，30 r/min，调节雾化压力、物料温度等，使物料保持沸腾。结果喷雾速率为20 r/ min 时制得颗粒质量较好。详见表5。

表5 抗早颗粒浸膏成型工艺单因素考察结果Tab.5 Results of the single- factor investigation for forming process of Kangzao Granules extract

雾化压力：称取糊精，置流化床制粒机底部，调节浸膏相对密度为1.15（60 ℃），喷雾速率为20 r/ min，调节雾化压力分别为0.08，0.12，0.16 MPa，调节物料温度等，使物料保持沸腾。结果雾化压力在0.12～0.16 MPa 之间较合适。详见表5。

物料温度：称取糊精，置流化床制粒机底部，调节浸膏相对密度为1.15（60 ℃），喷雾速率为20 r/min，雾化压力为0.12 MPa，调节物料温分别度为40，50，60，70 ℃，使物料保持沸腾。结果物料温度为50～60 ℃较合适。详见表5。

2.3.4 正交试验设计

根据单因素考察结果，将浸膏调成相对密度为1.15（60 ℃），采用L9（34）正交试验对雾化压力（因素A）、喷雾速率（因素B）、物料温度（因素C）进行考察。因素与水平见表6。

表6 流化床制粒工艺因素与水平Tab.6 Factors and levels of the fluidized bed granulation process

2.3.5 正交试验结果与分析

将糊精置流化床制粒机底部，取抗早颗粒浸膏，按L9（34）正交试验设计参数进行制粒，以颗粒得率和水分为考察指标。采用SPSS 17.0 统计学软件进行分析，结果见表7至表8。

表7 流化床制粒工艺正交试验设计与结果Tab.7 Design and results of the orthogonal test of fluidized bed granulation process

表8 流化床制粒工艺方差分析结果Tab.8 Results of ANOVA of the fluidized bed granulation process

可知，以颗粒得率为评价指标，因素A、因素B 对试验结果有显著影响，因素C 无显著影响，影响由大到小为A ＞B ＞C；不同水平的影响由大到小为A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，最佳成型工艺为A2B2C2。以颗粒水分为评价指标，各因素的影响由大到小为A ＞B ＞C，颗粒含水量较低，因素A、因素B、因素C对试验结果均无显著影响。故优选流化床制粒工艺为A2B2C2，即喷雾速率为20 r/min，雾化压力为0.14 MPa，物料温度为55 ℃。

2.3.6 验证试验

按优选工艺进行3 批验证试验，结果制得的颗粒色泽、大小均匀，外形圆整，表明该工艺稳定可行。详见表9。

表9 流化床制粒工艺验证试验结果（%）Tab.9 Results of the validation test of the fluidized bed granulation process（%）

3 讨论

3.1 水提工艺研究

根据药材性质及保持传统汤剂的有效成分，采用水煎煮提取的工艺［3］，同时用正交试验优化提取工艺［4］，既保留原方的优势和特点，又能充分提取药材的有效成分，与医院制剂的配制情况相符。影响水提效果的主要因素有浸泡时间、加水量、提取时间、提取次数等［5-6］。前期预试验结果显示，药材浸泡与否对试验结果无显著影响。

方中黄柏为君药，黄柏具有抗炎［7］、抑菌［8］、滋肾阴［9］的作用，且盐酸小檗碱为黄柏的主要有效成分［10-11］；干膏得率反映中药各组分提取的程度。故本研究中以盐酸小檗碱含量和干膏得率的综合评分为指标，考察水提工艺。

中药制剂在提取过程中，是否会造成有效成分破坏而影响药效，后续研究还需结合临床疗效观察和药效学考察，确定更加科学的提取工艺。

3.2 成型工艺研究

本研究中采用流化床制粒法制备抗早颗粒，流化床制粒是指提取物清膏不经干燥直接雾化后喷洒辅料，工艺过程中混合、制粒、干燥一步完成，可减少辅料用量，缩短制粒时间，减少有效成分损失，更符合《药品生产质量管理规范》要求［12］。

不同中药浸膏的特点，流化床制粒工艺参数的影响因素不相同［13-14］。制粒过程中的主要影响因素包括浸膏相对密度、喷雾速度、雾化压力、物料温度、出风口温度等［15-16］。浸膏相对密度高，浸膏黏度大，易堵塞喷头；相对密度太低制得的颗粒偏小，影响成品率。浸膏作为流化床制粒黏合剂，其喷雾速率是制粒成型的重要因素，喷雾速率越快，制得颗粒越大，但颗粒易黏结、塌床［17］；速率过慢耗时长，颗粒细粉过多。雾化压力也是制粒的重要影响因素，雾化压力高，颗粒粒径小，易干燥成粉末；压力低则雾滴大，易结块。物料温度高，颗粒干燥速度快，易失去黏合作用，产生过多细粉；物料温度低，颗粒来不及干燥，易黏结，甚至塌床［18］。

可见，不同工艺参数均影响颗粒得率和水分。故以颗粒得率、含水量为考察指标。目前，正交试验是中药颗粒剂成型工艺筛选的常用方法［19］。本研究中对浸膏相对密度、喷雾速率、雾化压力、物料温度进行单因素考察，在此基础上设计正交试验，以物料温度、雾化压力、喷雾速率为考察因素，同时以颗粒得率、含水量为考察指标，优选流化床制粒工艺。

3.3 方法评价

所优选的抗早颗粒的水提工艺和流化床制粒工艺稳定、可行，制得的颗粒溶化性好，大小适中，色泽均匀，可为该制剂的工业化生产提供参考。