丹参酮ⅡA对鼠环孢素性牙龈增生及Bcl-2阳性表达影响的研究

张馨予 马肃 丰靖馨 周慧玲 刘培红 李延武

[摘要]目的：观察丹参酮ⅡA对大鼠环孢素A（CyclosporinA，CsA）性牙龈增生上皮内Bcl-2表达的影响。方法：30只7周龄雄性Wistar大鼠随机等分为3组（对照组、CsA组、CsA+TanⅡA组），每组再随机等分为2个亚组（10 d组和20 d组）。实验周期结束时取材并制作切片，选择相同部位分别行HE染色及免疫组化PV两步法，于显微镜下观察并测量各组大鼠颊侧牙龈上皮面积和最长钉突长度，计数最长钉突内Bcl-2蛋白阳性细胞表达数，行完全随机分组两因素析因设计的方差分析。结果：颊侧牙龈上皮面积、最长钉突长度、抗凋亡蛋白Bcl-2阳性细胞数，CsA组显著大于对照组和CsA+TanⅡA组（P<0.05）;而CsA+TanⅡA组和对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：在本试验周期内，TanⅡA能有效地预防CsA引起的大鼠牙龈上皮增厚，Tan ⅡA抑制大鼠CsA性牙齦增厚上皮内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达可能是其机制之一。

[关键词]环孢素A;药物性牙龈增生;丹参酮ⅡA;上皮;Bcl-2

[中图分类号]R781.4    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）06-0084-04

Study on Influence of Tan ⅡA on Murine Cyclosporine Gingival Hyperplasia and Positive Expression of Bcl-2

ZHANG Xinyu1，MA Su1，2，FENG Jingxin1，ZHOU Huiling1，LIU Peihong1，2，LI Yanwu1

（1.Department of Periodontology;2.Longjiang Scholars Laboratory，the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，Heilongjiang，China）

Abstract： Objective This paper is to observe the effect of Tanshinone ⅡA （TanshinoneⅡA， TanⅡA） on the expression of Bcl-2 in the epithelium Cyclosporin A （CyclosporinA， CsA）-induced gingival overgrowth of rats. Methods Thirty 7-week-old male Wistar rats were randomly divided into 3 groups （control， CsA， CsA+TanⅡA）， and each group was randomly divided into 2 subgroups （10 days， 20 days）. At the end of the experimental cycle， samples were taken and sectioned， and the same parts were selected for HE staining and immunohistochemical PV. The area of buccal gingival epithelium and the length of the longest nail process of rats in each group were observed and measured under the microscope， the imaging analysis system was used to take pictures and measure the buccal gingival epithelial area and the longest spike length of each group of rats， count the number of Bcl-2 protein positive cells in the longest spike， and analyze two-way analysis of varianca of factorial design. Results The area of buccal gingival epithelium， the length of the longest nail process and the number of anti apoptotic protein Bcl-2 positive cells in CsA group were significantly higher than those in control group and CsA + Tan ⅡA group （P<0.05）， there was no significant difference between CSA + Tan ⅡA  group and the control group （P>0.05）. Conclusion  Within this test period， Tan ⅡA can effectively prevent CsA-induced gingival epithelial overgrowth in rats. Tan ⅡA inhibits the expression of intraepithelial anti-apoptotic protein Bcl-2 in CsA-induced gingival overgrowth in rats may be one of its mechanisms.

Key words： cyclosporine A; drug-induced gingival overgrowth; tan ⅡA; epithelium; Bcl-2

环孢素A（CsA）属于强效免疫抑制剂，其临床应用广泛，但其使用过程中会产生一种常见的副作用，即环孢素性牙龈增生（Cyclosporin A-induced gingival overgrowth，CsA-GO）[1]。牙龈上皮增厚是CsA-GO的主要病理特征之一，其发病机制可能与抗凋亡蛋白Bcl-2阳性表达明显增加有关[2]。在本课题组开展的丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，TanⅡA）对大鼠环孢素性牙龈增生干预治疗研究中发现，TanⅡA可有效缓解大鼠牙龈上皮的增生[3]。本实验以Wistar大鼠为实验对象，定量分析TanⅡA对CsA-GO大鼠牙龈上皮层的影响及TanⅡA对CsA-GO大鼠牙龈上皮内抗凋亡蛋白Bcl-2表达的影响，探讨TanⅡA缓解CsA所致的大鼠牙龈上皮组织部位特异性增厚的发病机制。

1  材料和方法

1.1 药物和仪器：CsA（瑞士诺华制药）;丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（上海第一生化药业有限公司）;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体（武汉博士德有限公司）;PV两步法免疫组织化学检测试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德有限公司）;Nikon ECLIPSE 80i显微镜、尼康NIS-ELements BR 3.0成像分析系统（日本尼康，哈医大一院龙江学者实验室）。

1.2 动物选择及分组：7周龄健康雄性Wistar大鼠30只（哈医大一院动物实验中心提供），随机等分为对照组、CsA组、CsA+TanⅡA组（每组各10只），每组又随机等分为10 d、20 d两组（每组各5只）。

1.3 建模：①CsA-GO动物模型：大鼠每日胃饲浓度为5 mg/ml的CsA鲜牛奶混浊液，CsA摄入量为30 mg/（kg·d），同时腹腔注射8 mg/（kg·d）的生理盐水;②CsA+TanⅡA动物模型：大鼠每日胃饲等量等浓度的CsA鲜牛奶混浊液，同时腹腔注射8 mg/（kg·d）的TanⅡA注射液;③对照组动物模型：大鼠每日胃饲不含CsA的等量鲜牛奶并腹腔注射等量等浓度生理盐水。所有大鼠都被安置在类似的条件下，每日称重并根据体重调整CsA和TanⅡA剂量。本研究经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准，批准编号：2020095。

1.4 取材、组织病理学检测：在实验周期（10 d、20 d）结束后，按实验设计处死各组大鼠。使用10%水合氯醛行大鼠腹腔注射麻醉，全麻下解剖暴露心脏，0.9%生理盐水和4%多聚甲醛经心脏灌注内固定。解剖获得大鼠牙体-牙周复合组织标本，4%多聚甲醛外固定24 h、4℃静止脱钙3个月，组织标本脱水、透明、浸蜡，然后以下颌第一磨牙近中面为包埋面常规石蜡包埋，颊舌向连续切片，片厚4 μm。选择下颌第一磨牙近远中面中点处切片4张，2张进行HE染色，2张行Bcl-2 PV两步法免疫组织化学染色，按试剂盒说明书进行操作。

光镜下观察各组牙龈组织形态，利用尼康NIS-Elements BR 3.0成像分析系统摄片，在100倍视野下采用手动测量选项分别测定颊侧上皮面积和最长钉突长度，具体测定方法如图1～2。

光镜下选取每张Bcl-2蛋白阳性切片中最长上皮钉突，并计算其内抗凋亡蛋白Bcl-2阳性表达的细胞数（表达呈棕褐色颗粒，定位于细胞胞浆内）。以上测量均由同1人完成，每个标本测2张切片，每张切片测3次，取平均值。

1.5 统计学分析：采用SPSS 26.0统计分析软件包对各组数值进行两因素析因设计方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1 组织形态学观察：与对照组相比，CsA组牙龈发生部位特异性的增厚，牙龈上皮的增厚均主要集中在附着龈，牙龈上皮棘层细胞层数和数量明显增加，上皮钉突数量增多、伸长增粗;与CsA组相比，CsA+TanⅡA组牙龈部位特异性的增厚均减轻，上皮棘层细胞层数和数量明显减少，上皮钉突数量减少、伸长减轻。见图3。

2.2 Bcl-2蛋白表达细胞观察：与对照组相比，CsA组Bcl-2阳性表达的细胞层厚度和细胞数量增加，阳性表达范围和表达密度增加主要集中于附着龈，上皮钉突处密集表达;与CsA组相比，CsA+TanⅡA组Bcl-2阳性表达强度弱，其与对照组Bcl-2蛋白的免疫反应性相似。见图4。

2.3 各因素析因设计方差分析结果：同一时间点内，不同处理方式的（CsA和TanⅡA）大鼠牙龈上皮面积、最长钉突长度和Bcl-2阳性细胞数也不同，CsA组显著大于对照组和CsA+TanⅡA组，差异有统计学意义（P<0.01），而CsA+TanⅡA组和对照组两组间相比，差异无统计学意义（P>0.05）;同一處理方式下，不同时间点内（10 d和20 d）大鼠牙龈上皮面积、最长钉突长度均无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），而CsA组Bcl-2阳性细胞数差异有统计学意义（P>0.05）。见图5～7，表1～2。

3  讨论

CsA-GO会危害口腔卫生和美观，也会影响到患者言语及咀嚼功能，严重时还会影响患者的心理健康。传统治疗CsA-GO的方法为寻找其他药物替代或停药，现代观点认为最主要的是牙周基础治疗，对于一些牙龈有明显炎症的患者可结合局部药物治疗（短疗程阿奇霉素、短疗程甲硝唑）;增生达到一定程度，牙龈外形不理想时需手术治疗介入。但上述治疗方法均有其不足之处[4]，所以本课题组考虑研究CsA-GO的微观病理变化，寻找CsA-GO新的预防治疗途径。

本课题组前期实验结果表明，在CsA给药后10 d，与相同时间点的对照组大鼠正常牙龈相比，CsA处理的大鼠颊侧牙龈上皮面积及最长钉突长度表现出显著的增加;在CsA给药后20 d，这种增加更为明显，而30 d至40 d增生程度逐渐减弱。根据动物实验中“3R”的原则，减少不必要的重复实验，所以本实验周期选用了牙龈增生最明显的10 d和20 d进行研究。

CsA-GO結缔组织的纤维性增生与瘢痕组织和实质器官纤维化的组织病理学特点相似[5]，所以本课题组选用抗纤维化的药物丹参酮试验性干预治疗CsA-GO。在前期实验中发现TanⅡA不但通过减少胶原沉积缓解了结缔组织增生[3]，且可以缓解CsA所致的大鼠牙龈上皮部位特异性的增厚。CsA-GO上皮增厚的确切发病机制尚不完全清楚，但目前的总体观点认为是增殖与凋亡之间失平衡。本课题组前期长期实验研究主要集中在凋亡相关蛋白表达变化方面，CsA使大鼠口腔龈上皮内抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，推测线粒体凋亡途径受到干扰，细胞凋亡受到抑制可能是CsA使大鼠口腔龈上皮增厚的发生机制之一[2]。

丹参酮ⅡA具有天然的抗癌活性[6]。TanⅡA可通过细胞凋亡途径抑制多种癌细胞系生长，包括人鼻咽癌[7]、口腔鳞状细胞癌[8]、食管癌[9]、恶性星形细胞瘤[10]、宫颈癌[11]和白血病[12]等。体外和体内模型表明TanⅡA可能是通过干扰线粒体途径，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，诱导癌细胞凋亡[13-16]。

HE染色分析表明，在本实验周期内，CsA处理可引起大鼠颊侧牙龈上皮组织面积及最长钉突增大，CsA对牙龈上皮的影响有部位特异性，上皮增厚主要位于颊侧附着龈;TanⅡA可有效预防CsA诱导的大鼠牙龈上皮面积增厚。笔者的数据表明，TanⅡA可以在预防大鼠中CsA牙龈过度生长方面发挥重要作用。本实验免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，CsA显著上调抗凋亡蛋白Bcl-2在牙龈上皮中的表达，与前期实验结果一致;而与CsA组相比，CsA+TanⅡA组大鼠颊侧牙龈上皮最长钉突内Bcl-2蛋白阳性细胞数下降。

细胞凋亡的内在途径，也称为线粒体损伤途径，起源于细胞内应激[17]。在发现Bcl-2（及其相关家族成员）后的几十年里，大量的研究揭示了Bcl-2蛋白质家族对内在凋亡途径的正确调控对于所有多细胞生物的正常发育和生理是必不可少的，Bcl-2蛋白的平衡被视为细胞凋亡的触发因素[18]。抗凋亡蛋白Bcl-2抑制上皮细胞分化和凋亡，在基底细胞层上的过度表达，与增生上皮角化层角化有关，抗凋亡蛋白Bcl-2过表达可能通过抑制晚期分化，牙龈上皮细胞凋亡受抑制，导致牙龈增生[19]。TanⅡA下调大鼠CsA-GO上皮内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，这可能是TanⅡA预防CsA-GO上皮增厚的机制之一，这与TanⅡA对各种肿瘤的研究中观察到的发现一致。

CsA-GO发病机制是多因素的[20]，一个被认为在病变的发病机制中起关键作用的因素是菌斑积聚和预先存在的牙周炎症状态。而许多研究报告表明，TanⅡA能抑制炎性细胞因子的表达[21]。TanⅡA对CsA-GO有抑制作用，其抑制机制可能是多方面的。TanⅡA是否通过线粒体凋亡途径促进大鼠CsA-GO牙龈上皮细胞凋亡活动，从而恢复牙龈生理形态有待进一步实验讨论，以阐明丹参酮上皮抑制机制，为其在CsA-GO临床预防治疗中的应用提供理论依据。

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[收稿日期]2020-04-02

本文引用格式：張馨予，马肃，丰靖馨，等.丹参酮ⅡA对鼠环孢素性牙龈增生及Bcl-2阳性表达影响的研究[J].中国美容医学，2022，31（6）：84-87.