响应面优化白芨多糖提取工艺及流变性研究

王自凡，卢永仲，张振

(1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025；2.贵州理工学院 食品与药品制造工程学院， 贵阳 550003；3.贵州省分析测试研究院，贵阳 550002)

多糖是由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等单糖按一定比例组成的天然高分子化合物[1]，来源广泛且安全性高，不仅具有抗氧化[2]、降血糖[3]、抗炎[4]、抗癌[5]等生物活性，而且具有增稠性[6]、乳化稳定性[7-8]、成膜性[9]等特性而作为增稠剂、乳化剂、成膜剂等被广泛应用于食品医药等行业。

白芨是一种传统可食用中药材，多糖是白芨块茎中最主要的活性物质，主要由葡萄糖和甘露聚糖组成，安全性高、黏性大。水提醇沉是白芨多糖最传统的提取方法之一[10]，具有操作简单、成本低、便于工业化生产等优点。聂胜祥[11]利用白芨做保健醋，该白芨醋酸甜适宜，且具有清热补血等功能。徐昌松等[12]用白芨制作豆腐不仅滋味鲜美，还具有止咳、预防溃疡的作用，除此之外，白芨多糖液还可以用作乳化剂[13]、水果保鲜剂[14]等食品添加剂使用。在食品加工生产中，浓度、加热温度和剪切速率等流变学特性对于多糖类的提取工艺、感官评价、产品研发、货架期评估等都具有重要意义[15-16]。

本研究对白芨多糖水提醇沉工艺进行了优化，在单因素试验的基础上，以白芨多糖提取率指标为响应面值，对在提取过程中影响提取率的主要因素料液比、提取温度、提取时间进行优化，并对试验结果进行了验证，分析了放置时间、加热温度、剪切速率和耐盐性对白芨多糖溶液黏度的影响，为白芨多糖在食品工业中的提取和生产研发提供了参考。

1 材料和方法

1.1 材料

白芨：3年生，购于贵州省遵义市湄潭县白芨基地。

1.2 试剂

石油醚、无水乙醇(均为分析纯)：天津市富宇精细化工有限公司；NaCl(分析纯)：茂名市雄大化工有限公司。

1.3 主要仪器与设备

DZ-2BCII真空干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；JE502电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；DHG-9240B电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司；XK-50实验室超纯水器 锦州市新科水处理设备厂；2N-1000A微型高速粉碎机 中南制药机械厂；L4-5K台式低速离心机 湖南可成仪器设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；NDJ-9S旋转黏度计 上海力辰仪器科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 白芨提取工艺流程

新鲜紫花白芨的假鳞茎冲洗干净，去须根，蒸制25 min左右，至无白心，切成薄片，于60 ℃干燥至恒重，粉碎。取适量白芨粉，加入石油醚以1∶30(g/mL，下同)的比例，40 ℃回流1 h；用质量分数为80%的乙醇，料液比1∶50，70 ℃回流2 h，重复2次得脱脂[17]、脱色的白芨粉。

采用水提醇沉方法[18]，用一定料液比，加热水浴提取3次，收集滤液，离心固液分离、浓缩、95%乙醇醇沉，4 ℃静置过夜，收集白色絮状物干燥后可得白芨粗多糖。

1.4.2 单因素试验

以白芨粗多糖提取率为指标，采用单因素试验研究料液比、提取温度、提取时间对多糖提取率的影响，试验水平分别选取料液比为1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)；提取温度为40，50，60，70，80 ℃；提取时间为1，1.5，2，2.5，3 h，对多糖提取条件进行初步优化，确定单因素试验参数范围。

1.4.3 响应面优化试验

为了达到白芨多糖的最佳提取工艺，本试验根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,在单因素试验的基础上以料液比、提取温度、提取时间作为影响因子，以多糖提取率为响应值，对白芨多糖的提取进行三因素三水平的优化设计，响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface design

1.4.4 白芨多糖黏度影响因素测定

1.4.4.1 放置时间和温度对白芨多糖溶液黏度的影响

以蒸馏水为溶剂，配制质量浓度为20 mg/mL的白芨多糖溶液，分别置于4 ℃和25 ℃环境下，每隔12 h测定在同一剪切速率(60 r/min)下溶液的黏度值变化。

1.4.4.2 不同剪切速度对白芨多糖溶液黏度的影响

配制质量浓度分别为5，10，20，30，40 mg/mL的白芨多糖溶液，在不同剪切速率(6，12，30，60 r/min)下测定多糖溶液的黏度值变化。

1.4.4.3 加热温度对白芨多糖溶液黏度的影响

配制质量浓度为20 mg/mL的白芨多糖溶液，分别加热至30，40，50，60，70，80，90 ℃，测定在同一剪切速率(60 r/min)下白芨多糖溶液的黏度值变化。

1.4.4.4 盐离子浓度对白芨多糖溶液黏度的影响

配制质量浓度为20 mg/mL的白芨多糖溶液，加入NaCl，使得溶液Na+浓度分别为0%、2%、4%、6%、8%、10%,测定在同一转速(60 r/min)下溶液的黏度值变化。

1.5 数据统计与分析

所有试验重复3次，采用Excel 2010对试验数据进行录入和计算，并用Design-Expert 8.0.6和OriginPro 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比考察结果

取5份白芨粉各5 g，提取温度为70 ℃，提取时间为1 h，料液比分别为1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，每组提取3次，分别计算白芨粗多糖得率，分析料液比对白芨多糖提取率的影响，结果见图1。

图1 料液比对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharide

由图1可知，随着料液比的增加，多糖的提取率逐渐上升，料液比为1∶60时提取率最高。白芨多糖提取液为黏稠状，料液比为1∶40以下时，多糖液和白芨渣不容易固液分离，随着溶液逐渐增多，细胞充分释放多糖，但当料液比超过1∶60时，多糖溶液浓度降低，猜测是浓缩过程导致多糖损失过多，发生降解，表现为提取率下降，而且料液比高，多糖浓缩耗时较长，也增加了生产成本。因此，控制白芨多糖提取料液比为1∶60左右为宜。

2.1.2 提取时间考察结果

本试验取5份白芨粉各5 g，料液比为1∶60，提取温度为60 ℃，提取时间分别为1，1.5，2，2.5，3 h，考察不同提取时间对白芨多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharide

由图2可知，随着时间的增加，多糖提取率逐渐增加，达到最大提取率的时间在1.5 h左右，由曲线的陡峭程度可以看出时间对多糖提取率的影响不是很大，在实际生产中，缩短提取时间可以降低提取成本，且随着时间延长，多糖长时间处于加热状态，发生降解，含量下降，所以控制提取时间为1.5 h左右。

2.1.3 提取温度考察结果

本试验以取5份白芨粉各5 g，料液比为1∶60，提取时间为1 h，提取温度分别为40，50，60，70，80 ℃，分别计算白芨粗多糖得率，考察提取温度对白芨多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 提取温度对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharide

由图3可知，温度对白芨多糖提取率的影响较大，随着温度上升，多糖提取率随之增大，达到最大提取率的温度为70 ℃，之后随着提取温度的升高，白芨多糖提取率反而下降，这可能是温度过高，多糖降解导致醇沉多糖得率减少。因此，控制提取温度为70 ℃。

2.2 响应面法优化试验设计及结果分析

在单因素试验基础上，以白芨多糖提取率为指标，依据Box-Behnken法进行试验设计，确定白芨多糖最佳提取工艺参数，响应面试验设计及结果见表2。

表2 白芨多糖提取工艺响应面试验设计及结果Table 2 The response surface experimental design and results of extraction process of polysaccharide from Bletilla striata

续 表

对表2中试验数据进行二次多项回归拟合，根据响应面试验设计原理，以白芨多糖提取率(Y)为响应值，料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)为自变量，设计三因素三水平的响应面试验，由回归分析结果可得3个因素对白芨多糖提取率的影响拟合回归方程为：Y=40.84-0.14A-0.54B-1.00C+0.35AB-0.33AC-0.075BC-2.55A2-1.75B2-2.22C2。

白芨多糖提取模型的方差分析结果见表3。

表3 白芨多糖提取回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model of extraction of polysaccharide from Bletilla striata

由表3可知，模型复相关系数R2=0.9742，模型的P<0.0001，表明回归模型极其显著，模型有意义；失拟项的P=0.7724>0.05，说明失拟项检验不显著，模型的拟合度良好；校正决定系数RAdj2=0.9410，说明方程的可信度很高，能准确描述试验结果；模型一次项C(提取温度)极显著，B(提取时间)显著，A(料液比)不显著，说明3个因素对多糖得率的影响程度为C>B>A；二次项中，A2、B2、C2的影响都极显著(P<0.01)。

对回归模型获得的响应曲面图见图4～图6。

图4 料液比和提取时间对提取率影响的响应面Fig.4 Response surface of the effects of solid-liquid ratio and extraction time on the extraction yield

图5 料液比和提取温度对提取率影响的响应面Fig.5 Response surface of the effects of solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction yield

图6 提取时间和提取温度对提取率影响的响应面Fig.6 Response surface of the effects of extraction time and extraction temperature on the extraction yield

由图4～图6可知，3个响应因素之间的交互作用都对白芨多糖的得率存在影响，由曲面的陡峭程度可以看出提取温度对多糖提取率的影响最大，而料液比对多糖提取率的影响最小，结合软件计算回归模型可以预测出白芨多糖提取的最佳工艺：料液比为1∶59.77，提取时间为1.42 h，提取温度为67.79 ℃，该条件下白芨多糖提取率为40.99%。

2.3 最佳工艺条件试验验证

根据模型得到的最佳工艺结合试验的可行性和精准度，将工艺条件调整为料液比1∶60、提取时间1.5 h、提取温度70 ℃，在此条件下进行试验，每组试验重复3次，以验证模型的准确性和预测结果。最终得到白芨多糖平均提取率为(40.82±0.28)%，与模型预测值相吻合，说明该试验具有可靠性和准确性，对今后白芨多糖提取工艺参数的选择具有一定指导意义。

2.4 白芨多糖黏度影响因素测定

2.4.1 放置时间结果分析

该工艺操作简单，可以获得白色透明且具有一定黏度的多糖溶液，可作为添加剂应用于日化、食品等领域，在实际生产应用中，储存条件是决定白芨多糖溶液质量的关键因素。本试验考察25 ℃和4 ℃环境下放置12，24，36，48，60，72 h多糖溶液的黏度值变化，结果见图7。

图7 放置时间对白芨多糖液黏度的影响Fig.7 Effect of storage time on the viscosity of Bletilla striata polysaccharide solution

由图7可知，随着放置时间的增加，多糖溶液黏度逐渐下降，这是多糖溶液中的内源性酶和微生物的共同作用导致，而25 ℃环境下多糖溶液下降速率高于4 ℃环境，这是因为在冷藏环境下，内源性酶和微生物活性较低，因此，在实际使用过程中，为了延长白芨多糖溶液的有效使用时间，需添加少量防腐剂且低温下保存。

2.4.2 剪切速度结果分析

白芨多糖在水溶液中牢牢抓住水分子，形成具有黏性的多糖胶液，在生产加工过程中，机器搅拌剪切速率会影响多糖溶液的性质[19]。本试验考察在25 ℃下，5，10，20，30，40 mg/mL浓度下的白芨多糖溶液分别在6，12，30，60 r/min剪切速率下的黏度变化，结果见图8。

图8 剪切速率对白芨多糖溶液黏度的影响Fig.8 Effect of shear rate on the viscosity of Bletilla striata polysaccharide solution

由图8可知，不同浓度下，同一剪切速率，多糖胶液浓度越大，黏度值越大；在相同浓度下，剪切速率越高，溶液黏度值越低，即多糖胶液的黏度随着剪切速度的增加而减小，即剪切稀释现象，因此，白芨多糖胶液具有假塑性，呈现出“非牛顿流体”特征。高浓度(20～40 mg/mL)下，溶液中的甘露聚糖大分子之间的静电阻力、氢键等作用较强，分子链缠绕增强，多糖溶液黏度值增加，剪切速度越大，定向作用越强，分子运动方向倾向于流动方向，减弱分子间缠绕，因此，溶液的黏度随着剪切速率的增加而下降，该结果与菠萝蜜多糖流变性研究结果一致。

2.4.3 加热温度结果分析

温度对白芨多糖溶液黏度的影响见图9。

图9 加热温度对白芨多糖溶液黏度的影响Fig.9 Effect of heating temperature on the viscosity of Bletilla striata polysaccharide solution

由图9可知，白芨多糖溶液的黏度随着溶液温度的升高而降低，随着溶液温度升高，分子间运动和扩散加剧，分子缠绕趋向松脱，在一定剪切力下，多糖溶液温度和黏度之间呈现负相关，即在一定温度范围内，温度越高黏度越小，不过随着温度升高，多糖链会不同程度降解变短，也会表现为黏度值下降。

2.4.4 耐盐性结果分析

白芨多糖液耐盐性研究见图10。

图10 白芨多糖溶液耐盐性研究Fig.10 Study on the salt tolerance of Bletilla striata polysaccharide solution

由图10可知，随着NaCl质量分数的增加，多糖溶液的黏度出现较为缓慢的降低，这可能是Na+与白芨多糖溶液中分子上的羟基反应，不利于分子间形成氢键，引起黏度下降[20]，也可能是白芨多糖本身属于中性非离子型多糖，受离子影响程度较小。总之，NaCl对白芨多糖溶液的影响不大，具有较好的耐盐性，可用于高盐食品。

3 结论

在单因素试验的基础上，以白芨多糖提取率为响应值进行响应面优化试验，结果表明，料液比、提取温度、提取时间对白芨多糖提取率均有影响，且影响显著顺序为：提取温度>提取时间>料液比，同时，得出最优提取工艺条件：料液比为1∶59.77，提取时间为1.42 h，提取温度为67.79 ℃，在此条件下白芨多糖提取率为40.99%。水提醇沉得到白芨多糖液为“非牛顿流体”，呈假塑性，具有较好的黏度；白芨多糖溶液的黏度与浓度呈正相关，随着剪切速率的增加呈现剪切稀释现象；随着温度的升高，白芨多糖溶液的黏度下降；室温(25 ℃)和冷藏(4 ℃)下，随着放置时间延长，黏度均下降，4 ℃下黏度下降速度慢；白芨多糖溶液的黏度随着加热时间的增加而降低；Na+的加入使多糖溶液的表观黏度缓慢减小；研究表明，优化后水提醇沉白芨多糖的提取率稳定，最优条件下白芨多糖溶液具有良好的黏性和耐盐稳定性，可广泛应用于高盐食品。