后半规管途径导入不同血清型腺相关病毒转染小鼠耳蜗内毛细胞的效果比较

刘 珊 郭 瑞 宋新雨 于倩茹 陈钟壡 梁文琦 滕 琪 龚树生 柳 柯*

(1.首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100050；2.首都医科大学耳聋疾病临床诊疗与研究中心，北京 100050)

听力损失目前是人类最常见的感官缺陷之一，约有一半的语前聋是由遗传原因造成的。每1 000个新生儿中就有一位患有先天性耳聋，其中60%以上是由遗传因素引起的，遗传性聋的群体发病率已超过27/1 000[1-3]。传统上可以采用助听器或是人工耳蜗植入术来治疗不同基因突变引起的遗传性耳聋，但除此之外，尚无有效的药物治疗手段。对于遗传性耳聋较为理想的干预方法是对基因突变位点精准修复，恢复听力。近年来的研究[4-6]表明，基因治疗已经成为一种治疗遗传性疾病可行且有前途的方法。

在基因治疗中，病毒载体的选择尤为关键。目前在基因治疗中最有效的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体、反转录病毒载体和慢病毒载体(lentiviral vectors，LVs)。在体外的基因治疗临床试验中，反转录病毒载体和慢病毒载体作为首选载体，而AAV载体目前是体内治疗遗传性耳聋的首选载体[7-8]，它具有高效的转导效率及良好的安全性，并且可以在体内长期持续表达[9-10]，这些特性使得AAV在各个领域的临床基因治疗中有越来越多的应用[11]。但是采用不同血清型、启动子和转染路径都可以影响AAV转染的效率。

经后半规管注射途径作为一种内耳局部给药的方式，使注射试剂在小鼠耳蜗及前庭中广泛并均匀分布，且对其听力和前庭功能损害最小，已被证明是一种将局部药物输送到内耳简单且高效的方法[12-15]。

随着遗传性耳蜗内毛细胞及带状突触疾病越来越多地被发现和鉴定，针对耳蜗内毛细胞的AAV转染效率受到了更多的关注。为此在本研究中，通过半规管注射途径检测了4种AAV载体：AAV8、AAV9、AAVie、Anc80L65 在小鼠耳蜗内毛细胞中的转染情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究采用6～8周龄C57BL/6J小鼠20只，雌雄不限，购于北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物许可证号：SYXK(京)2019-0010，实验动物的使用遵循医学实验动物管理实施细则以及首都医科大学实验动物管理细则。实验动物采用数字表法随机分为5组，每组4只，均以左耳为手术耳。分为AAV8病毒导入组、AAV9病毒导入组、AAVie病毒导入组、Anc80L65病毒导入组，每只小鼠经后半规管导入病毒溶液2 μL；正常对照组，每只小鼠经后半规管导入0.9%(质量分数)氯化钠注射液2 μL。术前1天进行听力初筛，后半规管手术后2周行听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)检测后取小鼠耳蜗进行免疫荧光染色观察转染情况。小鼠饲养于首都医科大学实验动物部，每笼最多5只，可自由进食和饮水，提供12 h/12 h的明/暗环境。所有实验步骤均通过首都医科大学动物伦理委员会批准，伦理学审批号：AEEI-2021-298。

1.2 主要材料

携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的AAV8、AAVie、Anc80L65病毒悬液购于广州派真生物技术有限公司，效价均为：1E+13GC/mL；AAV9病毒悬液来自于北京大学邓宏魁教授细胞分化与干细胞研究室的馈赠。

1.3 手术方法

实验动物用腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg, Sigma公司，美国)和甲苯噻嗪(10 mg/kg, Sigma，美国)，进行麻醉，麻醉成功后放置保温毯上进行备皮，乙醇消毒手术区域，采用左耳耳后切口，充分暴露后半规管，用26号注射器针头在后半规管戳一小孔，将微管插入小孔中(图1)，用微量注射泵导入2 μL病毒溶液。随后拔出微管同时用一小块肌肉封堵入口，复位肌肉及皮下组织，用缝线缝合切口。

图1 经后半规管导入手术示意图(术耳为左耳) Fig.1 Schematic diagram of operation through posterior semicircular canal (left ear for operation)

1.4 ABR检测

分别于术前及术后2周对小鼠进行ABR检测听力功能。将麻醉后的小鼠置于标准屏蔽隔音室内，用美国TDT RZ6机器进行检测，将记录电极置于前额正中皮下，参考电极置于检测耳后皮下，接地电极置于非测试耳后皮下，外置放大器置于测试耳一侧。刺激声采用短声和短纯音，选择4、8、16、32 kHz为测听频率点，记录波形。刺激强度从90 dB SPL开始，按10 dB递减，接近阈值时按5 dB递减，直到检测不出重复的ABR波形，此刺激声强度为小鼠的听阈。

1.5 内耳标本的制备

术后两周行ABR测听后处死动物，取出耳蜗，显微镜下于蜗尖处打孔，刺破圆窗膜及卵圆窗膜后放入4%(质量分数)多聚甲醛中4 ℃避光过夜。随后将耳蜗放于10%(质量分数)乙二胺四乙酸钠(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)中脱钙2 h，在显微镜下剥离蜗壳，切除多余血管纹、螺旋韧带，撕下盖膜及前庭膜，将基底膜切为顶中转及中底转进行免疫荧光染色。

1.6 免疫荧光染色

将制备好的基底膜放于0.3%(体积分数)TritonX-100(Sigma-Aldrich,美国)和5%(体积分数分数)山羊血清(ZSGB-BIO公司, 中国)在室温下孵育2 h，加稀释兔源性Myosin(1∶300，Proteus BioSciences 公司，美国 )一抗4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，加二抗山羊抗兔568(1∶300)室温孵育2 h，PBS漂洗3次后用DAPI封片，激光共聚焦显微镜观察GFP分布并拍片。

1.7 细胞计数

在激光共聚焦图像中计数500 μm长度的基底膜，计算每一段基底膜中表达GFP的内毛细胞数比例。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组术前和术后ABR阈值测试结果

术后1 d发现有2只小鼠拎起尾巴有旋转现象，术后3 d症状消失，恢复正常，其余小鼠未见有歪头、步态不稳等前庭功能受损等表现。术后2周ABR检测后取材时肉眼观中耳清洁，未见中耳积液及内耳炎性反应等表现。将AAV8注射组、AAV9注射组、AAVie注射组、Anc80L65注射组听力数据分别与术前及对照组听力数据进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见图2。

图2 手术前后小鼠ABR变化 Fig.2 Changes of ABR in mice before and after operation

2.2 耳蜗内GFP表达

在导入2周后对小鼠耳蜗取材进行免疫荧光染色，GFP荧光标记病毒转染的细胞，Myosin标记毛细胞，DAPI标记细胞核，激光共聚焦显微镜下观察GFP在耳蜗组织中的分布。

激光共聚焦显微镜下观察AAV8在耳蜗基底膜中的表达(图3)，GFP分布在内毛细胞区域，但密度较低，AAV8在耳蜗顶中转内毛细胞的转染效率为34.6%±1.8%，中底转内毛细胞转染效率为39.0%±5.9%。

图3 AAV8导入2周后GFP在基底膜的分布Fig.3 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after AAV8 introduction

2.3 AAV9、AAVie、 AL80L65在耳蜗中的表达

激光共聚焦显微镜下观察AAV9在耳蜗基底膜的表达，可见其GFP均匀且广泛分布在内毛细胞区域(图4)，AAV9耳蜗顶中转内毛细胞转染效率为92.5%±1.1%，中底转内毛细胞转染效率为94.6%±1.0%，其转染效率在顶中转及中底转均显著高于AAV8及Anc80L65。

图4 AAV9导入2周后GFP在基底膜的分布 Fig.4 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after AAV9 introduction

激光共聚焦显微镜下观察AAVie在耳蜗基底膜的表达，可见其GFP广泛且高效分布在内毛细胞区域(图5)。耳蜗顶中转转染效率为96.7%±1.5%，中底转内毛细胞转染效率为97.7%±0.8%。

图5 AAVie导入2周后GFP在基底膜的分布 Fig.5 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after AAVie introduction

激光共聚焦显微镜下观察Anc80L65在耳蜗基底膜的表达(图6)，GFP普遍分布于内毛细胞区域，耳蜗顶中转内毛细胞转染效率为62.5%±3.3%，中底转内毛细胞转染效率为63.1%±6.1%(图7)。

图6 Anc80L65导入2周后GFP在基底膜的分布 Fig.6 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after Anc80L65 introduction

图7 各组病毒溶液在小鼠耳蜗中的转染率比较 Fig.7 Comparison of transfection efficiency of virus solution in mouse cochlea

正常对照组未见GFP表达，在耳蜗顶中转及中底转中，AAV9、AAVie分别比AAV8、Anc80L65转染率高，组间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

基因治疗是随着DNA重组技术的成熟而发展起来的，是医学和药学领域的一次重大技术进步[16]。基因治疗目前多采用的方法是通过病毒载体将遗传物质引入靶细胞，通过纠正或补充有缺陷的基因来治疗或预防遗传性疾病。基因治疗的优点效果是长期的，不需要反复进行手术操作。

腺相关病毒是目前研究中最活跃的基因治疗的首选载体[17]，它具有装载量大(36 kb)、相对广泛的趋向性、低免疫原性和非致病性等独特的临床引用特点，且可以长期稳定表达。迄今为止，至少有 12 种天然血清型和 100 多种 AAV 变体已被分离出来并作为基因传递载体进行研究，并且从这些载体中不断产生 AAV 突变体，以优化 AAV 用于基因传递的用途。然而，尽管AAV载体在临床上取得了良好的治疗效果，但其转染效率和诱导对AAV转染细胞的免疫应答的趋势也引起关注。本研究中，注射AAV病毒的各组与正常对照组ABR阈值比较也可以发现，AAV病毒对小鼠本身ABR没有影响，且AAVie及AAV9经半规管途径导入到内耳后在内毛细胞有较高的转染率，这说明AAV作为一种基因治疗的病毒载体是安全且高效的。这为今后在基因治疗如OTOF、SLC17A8、SMAD4等基因突变导致的听神经病中病毒载体的选择提供了更多思路[18-19]。

经半规管注射方式并未引起小鼠耳蜗ABR阈值的显著改变，耳后入路经后半规管注射手术创伤较小，所以后半规管手术方式是一种既可以保存听力，又能有效的将目的基因导入耳蜗的有效路径。对动物手术来说，相对于耳蜗圆窗手术，半规管更容易暴露，对神经和血管损伤较小，对耳蜗正常结构组织破坏性小，对前庭功能也并无损害。

本研究中发现有2只小鼠术后第1天起尾巴时有旋转的现象，但是在术后3 d症状消失，考虑是术后由于个体差异导致的前庭器官应激反应[20]。之前的研究表明，多种因素包括小鼠年龄、载体血清型、启动子类型、注射方法和病毒效价都会影响病毒在小鼠内耳的细胞靶向性以及转导效率[21]。在本实验结果中AAV8及Anc80L65的转染效率并不高，AAVie和AAV9虽然在内毛细胞转染效率较高，但都只能转染到内毛细胞，外毛细胞和支持细胞均未观察到GFP表达。分析可能的原因有：以往的研究[18-21]中病毒转染途径大多采用经圆窗途径给药，因为圆窗在解剖学上比后半规管更靠近耳蜗，但又容易损害小鼠听力。其次通过后半规管传递的病毒溶液可能会被半规管中的淋巴液稀释，这会降低其浓度并限制其感染整个耳蜗的能力。另外，其他研究中多采用P7以内新生小鼠进行手术，这也是本研究的不足之处，只研究了AAV8、AAV9、AAVie、Anc80L65在成年小鼠经半规管给药后对内耳的转染情况，其他手术方式及小鼠年龄有待进一步研究，以寻求更高效的转染效率。

总之，本研究表明经后半规管注射AAVie、AAV9可以在内耳内毛细胞高效转染并对听力没有显著影响，因而可以在日后的基因治疗中作为一种载体选择，特别是对耳蜗内毛细胞及带状突触的遗传性听力损失干预而言，这种病毒应用价值较大。当然，目前对于腺相关病毒载体的不断探索以及内对耳局部给药方式的不断完善，如经后半规管给药、经圆窗膜显微注射、鼓室注射、中阶给药等，为今后在遗传性疾病的临床治疗打下了坚实的基础。

利益冲突所有作者声明无利益冲突。

作者贡献声明刘珊：研究设计、数据收集和论文撰写; 于倩茹：数据收集; 郭瑞、宋新雨、陈钟壡、梁文琦、滕琪：数据分析; 龚树生、柳柯：研究设计和论文指导。