松叶猪毛菜NADP-苹果酸酶基因家族及启动子克隆分析

张玉慧，王玉兰，夏春兰，闻志彬*

(1 中国科学院新疆生态与地理研究所，荒漠与绿洲生态国家重点实验室，乌鲁木齐 830011; 2 中国科学院新疆生态与地理研究所标本馆，乌鲁木齐 830011; 3 中国科学院大学，北京 100049)

NADP-苹果酸酶(NADP-ME)是C4植物的关键光合酶，参与生物体内L-苹果酸代谢。在Mg2+或Mn2+存在的情况下，催化苹果酸发生氧化脱羧反应生成丙酮酸、CO2和NADPH[1]。NADP-ME由一个小的基因家族编码，一般包括3～5个基因[2-9]。大多数植物NADP-ME序列都比较保守，其氨基酸序列含有5个保守区域，即保守区域Ⅰ(VYTPTVGEACQK-YG)、Ⅱ(IQVIVVTDGERILGLGDLGCQGMGIPV-GKL)、Ⅲ(QFEDFANHNAF)、Ⅳ(FNDDIQGTASVVL)和Ⅴ(LFLGAGEAGTGIAEL)[10]。在植物中根据NADP-ME行使的功能不同，可将其分为光合型NADP-ME和非光合型NADP-ME。光合型NADP-ME定位在C4植物维管束鞘细胞的叶绿体和景天酸代谢(CAM)植物的细胞质中，为光合反应中CO2的固定提供CO2[10]；非光合型的NADP-ME位于C3、C4和CAM植物叶绿体或细胞质中[1]，与植物的许多生理功能有着密切的关系，如防御应答、脂肪酸生物合成以及pH调节等[11-14]。

NADP-ME家族在不同植物中的组织表达模式存在差异。拟南芥含有4个NADP-MEs，其中NADP-ME1(AT1)在根中表达量较高，NADP-ME2(AT2)和NADP-ME4(AT4)在根、茎、叶和花中都有表达，NADP-ME3(AT3)在花中表达量较高[2]。玉米包含5个NADP-MEs，其中Zmcyt3-NADP-ME、ZmC4-NADP-ME和ZmnonC4-NADP-ME在不同器官表达模式具有差异。Zmcyt3-NADP-ME主要在茎中表达，ZmC4-NADP-ME在叶鞘和叶片中表达量较高，ZmnonC4-NADP-ME在穗中表达量较高；Zmcyt1-NADP-ME和Zmcyt2-NADP-ME在叶、茎、根、叶鞘、未成熟和成熟的穗以及授粉14 d籽粒中都有表达[3]。小麦含有2个NADP-MEs(TaNADP-ME1和TaNADP-ME2)，它们在根、茎和叶中均表达，且TaNADP-ME1在叶中表达量较高[4]。水稻包含4个NADP-MEs，其中OschlME、OscytME1和OscytME3在水稻根、叶和穗上都有表达，而OscytME2在根中表达量较高[8]。

不同植物NADP-ME家族成员在应对非生物胁迫中存在差异。对谷子7个NADP-MEs进行ABA、低温和盐胁迫后，SiNADP-ME1和SiNADP-ME6的相对表达量变化最大，SiNADP-ME1在上述胁迫下的相对表达量分别为对照的460.53、411.50和15.24倍；SiNADP-ME6的相对表达量分别为对照的211.13、15.21和643.99倍，而其他基因的表达量上调范围均在对照的5倍以内[15]。对玉米5个NADP-MEs进行ABA胁迫，发现ABA诱导Zmcyt3-NADP-ME表达，ABA处理下其在根中表达量约是对照的90倍，其他基因除Zmcyt3-NADP-ME下调表达外，上调表达均在对照的4倍以内[3]。

启动子是转录水平调控的重要元件，而转录水平调节是基因表达调控的重要环节[16]。启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控相应基因表达以及提高植物的抗逆性。因此研究启动子的结构和功能对于基因表达调控机制的研究具有重要意义[17-19]。目前有关NADP-ME启动子的研究较少，仅见在C3和C4植物，且研究集中在启动子克隆、元件预测分析及表达特性等方面[15, 20-24]。Walter等[20]分离得到编码菜豆NADP-ME(PvME1)启动子区域ATG上游2 664 bp，并预测了该区域2个与紫外光和真菌响应有关的顺式作用元件。李秀峰[22]克隆得到了水稻胞质型OscytME2的启动子1 652 bp，连接GUS载体转化拟南芥后发现GUS基因在植物生长不同时期表达部位不同，主要表达于主叶脉中。陈莉敏[23]克隆得到水稻OscytME3启动子1 777 bp，具有较低的活性，其表达可能受多种逆境环境因子诱导。赵晋锋等[15]利用PlantCARE在线软件对谷子7个NADP-ME(SiNADP-ME)成员启动子顺式元件进行分析，发现SiNADP-ME成员启动子区域主要包括激素类应答元件、逆境应答元件、光应答元件以及其他类生长调控相关顺式元件，其中细胞周期调控元件MSA-like只存在于SiNADP-ME1启动子中，昼夜节律元件circadian只存在于SiNADP-ME3启动子中，根特异性motif I只存在于SiNADP-ME6启动子中。

松叶猪毛菜(SalsolalaricifoliaTurcz. ex Litv.)隶属于藜科猪毛菜族[25]，主要分布于蒙古、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦和中国(新疆北部、内蒙古、宁夏和甘肃)[26-27]。松叶猪毛菜是典型的C3-C4中间型植物[28-30]，具有区别于C3和C4植物的光合结构和生理特征[31]。为了解中间型植物NADP-ME家族成员及其启动子的结构和功能，本研究以松叶猪毛菜为研究对象，在鉴定克隆获得NADP-ME家族基因序列的基础上，基于荧光定量PCR(RT-qPCR)分析非生物胁迫下该家族成员的表达特征，并克隆NADP-MEs的启动子序列，对其顺式元件进行生物信息学分析和预测。通过本研究初步认识松叶猪毛菜NADP-ME家族成员及其启动子的结构和功能，为进一步研究该中间型植物NADP-ME的功能和进化奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

松叶猪毛菜(SalsolalaricifoliaTurcz. ex Litv.)种子采自新疆博乐，取适量种子经消毒后置于1/2MS固体培养基，在人工气候箱中进行萌发(萌发条件：白天25 ℃、14 h；夜晚18 ℃、10 h；光照强度2 200 Lx)，待萌发后转移至霍格兰营养液进行培养(培养条件白天25 ℃、14 h；夜晚18 ℃、10 h；光照强度6 000 Lx)。培养1周后，将光照强度升高至24 000 Lx，其他条件不变，取30 d苗龄的叶片保存在-80 ℃冰箱中以备后续提取DNA。

1.2 方 法

1.2.1 松叶猪毛菜基因组DNA的提取采用天根的植物基因组DNA提取试剂盒提取30 d松叶猪毛菜叶片的DNA，并利用1%的琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白定量仪Nanodrop 2000检测显示DNA的浓度和质量。

1.2.2 松叶猪毛菜NADP-ME基因家族的克隆根据前期实验组测得的松叶猪毛菜根、茎和叶混合的转录组数据，收集注释为NADP malic enzyme的所有unigene，共发现了6条unigene，其中2条为污染序列，将其剔除；2条unigene序列完全一致，实为一条转录本。在NCBI数据库中比对确定3条序列，均包含完整的ORF。根据序列利用DNAMAN 7设计引物(表1)，并以松叶猪毛菜基因组为模板，克隆得到松叶猪毛菜NADP-ME基因家族成员序列。

1.2.3NADP-ME家族基因生物信息学分析在Tair数据库(https://www.arabidopsis.org)下载拟南芥NADP-ME基因家族AT1(AT2G19900.1)、AT2(AT5G11670.1)、AT3(AT5G25880.1)和AT4(AT1G79750.1)序列，并利用DNAMAN 7软件对松叶猪毛菜和拟南芥NADP-ME基因家族进行多重序列比对。

1.2.4 组织表达及胁迫表达分析松叶猪毛菜正常条件下培养30 d，一部分材料收集根、茎和叶用于基因表达组织部位分析；另一部分幼苗进行ABA、NaCl、NAHCO3和PEG6000胁迫，将幼苗用不同浓度的ABA(0、50、100、150和200 mmol/L)、NaCl((0、50、100、150和200 mmol/L)、NaHCO3(0、15、30、45和60 mmol/L)和PEG6000(0%、10%、20%、30%、40%、50%和60%)进行胁迫处理，4 h后收集叶和根部，将未处理样品设为对照组；液氮速冻，-80 ℃备用。

提取松叶猪毛菜总RNA，根据已克隆的NADP-ME序列设计引物，反转录后利用qRT-PCR技术对松叶猪毛菜3个NADP-MEs在植物组织中及在非生物胁迫下的表达特性进行分析。根据Zhang等[32]研究，选择β-actin作为组织表达特性及正常情况下的内参，GAPDH和TUB分别作为ABA和NaHCO3胁迫下的内参基因，EF1a作为NaCl和PEG6000胁迫下的内参基因(表1)。qRT-PCR反应程序为： 94 ℃预变性5 min；34个循环，包括95 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s， 72 ℃延伸20 s； 72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.5 松叶猪毛菜NADP-ME家族基因启动子克隆及生物信息学分析利用mhiTAIL-PCR[33]和Genome Walking Kit方法克隆松叶猪毛菜NADP-ME家族成员的启动子序列。根据已知编码区序列，分别设计3条巢式PCR特异性引物(表2)，以松叶猪毛菜基因组DNA为模板进行DNA步移。将获得的特异性产物与pMD18-T连接，并转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定阳性转化子后送测。根据测序结果设计上下游引物(表2)，并从基因组DNA中扩增，经电泳检测到清晰条带，将目标片段切胶回收进行TA克隆，测序获得最终启动子序列。

表2 引物名称及序列

利用BDGP(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)中Neural Network Promoter Prediction在线工具对SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的转录起始位点进行预测。利用在线软件PLACE(https://www. dna.affrc.go.jp/PLACE)和Plant Care(http:// bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html)对启动子序列上顺式作用元件的种类、数量和功能进行预测分析。

1.2.6 数据分析运用Excel 2019分析处理数据，所有处理进行3次生物学重复，2次技术重复。用2-ΔΔCt方法处理数据，利用GraphPad Prism 8作图。

2 结果与分析

2.1 松叶猪毛菜NADP-ME家族基因的克隆

根据unigene基因序列设计引物，以松叶猪毛菜的cDNA为模板，进行RT-PCR克隆，得到3个NADP-MEs的基因序列。利用DNAMAN 7软件对松叶猪毛菜和拟南芥NADP-ME基因家族成员进行多重序列比对，根据其与拟南芥NADP-ME序列的相似性高低，将这3个基因序列命名为SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4，它们CDS序列长度分别为1 755、1 758和1 941 bp(图1)。

2.2 NADP-ME家族基因生物信息学分析

利用DNAMAN 7软件对松叶猪毛菜和拟南芥NADP-ME基因家族进行多重序列比对，结果(图2)发现松叶猪毛菜NADP-ME基因家族非常保守，都含有5个保守区域，除了在保守区Ⅰ-Ⅲ有个别碱基不同外，保守区Ⅳ-Ⅴ序列一致。

2.3 松叶猪毛菜NADP-ME家族成员的表达分析

2.3.1 组织表达特异性分析对松叶猪毛菜3个NADP-MEs在组织中的表达情况进行分析，将它们在茎中的表达量设为1.0。结果表明SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在根、茎和叶中都有表达，其中SaNADP-ME2和SaNADP-ME4 表达量表现为叶>茎>根，而SaNADP-ME1表达量表现为根>茎>叶(图3)。

2.3.2 非生物胁迫下NADP-ME家族成员松叶猪毛菜幼苗中的表达分析由于SaNADP-ME1主要在根中表达，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4主要在叶中表达，因此对非生物胁迫下SaNADP-ME1在根中以及SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在叶中的表达进行深入研究。在ABA胁迫处理下，SaNADP-ME1在根中的表达量明显下降，并在ABA质量浓度为200 mmol/L时达到最低 (将对照组基因的表达量作为参照，设为1.00，下同)；SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在叶中的表达量随着ABA质量浓度的增加而上升，且在ABA质量浓度为200 mmol/L时表达量达到最高(图4，A和图5，A)。在盐胁迫下，SaNADP-ME1和SaNADP-ME2表达量变化均不明显，SaNADP-ME4表达量随着盐质量浓度的增加呈现出先增加后减小的趋势，在100 mmol/L处理下达到最高(图4，A和图5，B)。在NaHCO3胁迫下，随着质量浓度的增加，SaNADP-ME1呈现先下降后上升的趋势，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4表达量没有明显变化(图4，B和图5，C)。在PEG6000胁迫下，SaNADP-ME1在50%PEG600表达量明显较低，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4 在40%PEG6000时表达量最高，在其余体积浓度百分比表达量变化均不明显(图4，C和图5，D)。结果表明，在ABA、NaCl、NAHCO3和PEG6000胁迫下松叶猪毛菜3个NADP-MEs均可被诱导表达，且SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的表达模式相似。

2.4 松叶猪毛菜NADP-ME家族基因启动子的克隆

为了克隆SaNADP-ME1启动子区域，利用Genome Walking Kit进行了3次DNA步移，获得3段特异性产物，长度分别为757、967和1 263 bp；利用mhiTAIL-PCR方法和Genome Walking Kit各进行了1次DNA步移，共克隆得到SaNADP-ME2启动子的2段特异性产物，长度分别为846 和589 bp；利用mhiTAIL-PCR和Genome Walking Kit方法克隆SaNADP-ME4启动子区域，共进行2次DNA步移，获得2段特异性产物，长度分别为1 450和2 203 bp。利用DNAMAN软件将多次步移获得的启动子片段拼接成完整序列，根据序列两端分别设计上下游引物(表3)，并从基因组DNA中扩增。经电泳检测后测序，结果表明克隆得到SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的启动子区域序列长度分别为2 351、1 655和2 887 bp(图6)。

2.5 NADP-ME基因家族启动子生物信息学分析

利用BDGP对松叶猪毛菜NADP-ME基因家族启动子进行转录起始位点预测，结果分析表明它们转录起始位点大约位于150～250 bp之间。SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4转录起始位点分别位于翻译起始位点(ATG)上游164 bp处(为碱基A)、162 bp处(为碱基C)和207 bp处(为碱基A)。

利用PLACE和Plant Care对启动子区域进行顺式作用元件分析(表3)，结果表明这3个NADP-MEs启动子区域都普遍存在组织和器官特异性表达元件、光响应元件及激素响应元件，其中与组织或器官特异性表达相关的元件有叶肉特异性元件CAC-TFTPPCA1和根特异性元件ROOTMOTIF-TAPOX1等；参与调控光合基因表达的顺式作用元件有G-box、Box4、ACE、ATC-motif、GT1CONSENSUS和EBOXBNNAPA等，其中ATC-motif仅在SaNADP-ME1启动子序列中发现，ACE和GT1-motif元件仅在SaNADP-ME4启动子序列中发现；参与激素响应的元件有水杨酸诱导元件、脱落酸诱导元件、生长素诱导元件和茉莉酸甲酯诱导元件等，其中生长素诱导元件TGA-element仅在SaNADP-ME4中存在。此外，在3个基因启动子区域还发现干旱诱导相关元件和厌氧诱导元件等，其中参与干旱诱导的MYB结合位点MBS仅在SaNADP-ME4中存在。

表3 松叶猪毛菜NADP-ME家族基因启动子区域顺式作用元件分析

3 讨 论

NADP-苹果酸酶(NADP-ME)是C4植物光合作用中的关键酶，在生物和非生物胁迫中发挥了重要的作用。本研究以C3-C4中间型植物松叶猪毛菜为研究材料，克隆得到其3个NADP-MEs(SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4)及启动子序列。NADP-ME家族在不同植物中组织表达模式存在差异，如小麦、水稻、玉米和拟南芥等[2-5]，本研究发现松叶猪毛菜这3个NADP-MEs组织表达模式也存在差异。虽然他们在根、茎和叶都有表达，但SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在叶中表达量最高，SaNADP-ME1在根中表达量最高。

Fu等[4]发现外源激素ABA可以调节小麦中TaNADP-ME1和TaNADP-ME2的表达。Liu等[34]发现在NaHCO3、NaCl和PEG6000的存在下，水稻幼苗叶和根中的NADP-ME活性增加50%以上。这些表明ABA、NaHCO3、NaCl和PEG6000均可以诱导NADP-ME的表达。本研究发现在4种非生物胁迫(ABA、NaCl、NaHCO3和PEG6000)下，松叶猪毛菜幼苗中这3个NADP-MEs均可被诱导表达，其中SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在叶中响应非生物胁迫的表达模式相似，对干旱响应最为明显，在干旱胁迫下最大表达量约为对照组的3倍，SaNADP-ME1在根中对ABA和NaHCO3的响应更加明显，在ABA胁迫和NaHCO3下最小表达量为对照组的0.5倍，推测松叶猪毛菜NADP-ME基因家族可能在响应ABA、盐胁迫、渗透压和干旱胁迫中发挥了重要作用。

松叶猪毛菜NADP-ME家族基因启动子顺式作用元件预测结果显示，其启动子区域含有各种激素响应元件、生物和非生物响应元件，以及一些组织或器官特异性元件。与松叶猪毛菜其他2个NADP-MEs相比，SaNADP-ME4中还存在光反应顺式作用元件ACE、GT1-motif元件、生长素诱导元件TGA-element以及参与干旱诱导的MYB结合位点MBS。qPCR结果表明在PEG6000胁迫下，SaNADP-ME4在叶中的表达量有明显变化，干旱诱导的MYB结合位点MBS可能在SaNADP-ME4响应干旱中发挥了重要作用。SaNADP-ME1在根中表达量最高，且ABA胁迫处理下，SaNADP-ME1在根中的表达量下降，并在ABA质量浓度为200 mmol/L时达到最低。Arias等[35]推测AT1在ABA信号响应中发挥着特殊的作用。通过生物信息学分析显示SaNADP-ME1与AT1启动子都含有脱落酸诱导元件ABRE，该元件可能在SaNADP-ME1响应ABA中发挥着重要作用。

本研究通过对松叶猪毛菜3种NADP-ME启动子顺式作用元件进行生物信息学分析和预测，初步认识NADP-ME启动子的结构和功能，为后续研究NADP-ME家族基因奠定了基础，也为深入研究C4植物光合基因的功能和进化提供了理论依据。