磁性固相萃取-液相色谱-质谱联用测定环境水中13种三嗪类除草剂

刘 翔 滕 姣 周 艳 梁俊阳, 陈学国

（1 中国刑事警察学院研究生院 辽宁 沈阳 110035；2 广东司法警官职业学院司法鉴定系 广东 广州 510520；3 中国刑事警察学院刑事科学技术学院 辽宁 沈阳 110035；4 吉林省公安厅物证鉴定中心 吉林 长春 130117）

1 引言

作为农业生产中必不可少的生产资料，除草剂自问世以来，因其具有杀草谱广、使用方法简便、除草效果好、成本低等特点而被广泛应用[1]。作为除草剂中使用量大、种类多的一类，三嗪类除草剂不易分解、残留时间长，对土地、庄稼、水资源易造成污染，已被全球大多数国家和地区列入危险物质名单[2]，但由于其使用广泛，在自杀、误服、投毒案件中经常出现[3]。

针对三嗪类除草剂的分析方法有气相色谱（GC）法[4]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）法[5]、液相色谱（HPLC）法[6]、液相色谱-质谱联用（LC-MS）法[7]和毛细管电泳（CE）法[8]等，其中LC-MS法可同时分析多种目标物，显示出选择性好、灵敏度高等优点。水样中三嗪类除草剂的预处理方法有液-液提取（LLE）法[9]、固相萃取（SPE）法[10]、固相微萃取（SPME）法[11]等，其中固相萃取法具有操作简便，因净化与富集能力强等优点得到了更为广泛的应用。

磁性固相萃取是近年发展起来的一种新型分散固相萃取技术[12]，其基本原理是将具有磁性或已经被磁化的材料作为吸附剂，在样品的悬浮液或溶液中加入吸附剂，目标待测物将会吸附到磁性吸附剂表面。在外部磁力作用下，目标待测物随吸附剂一起转移到其他容器中，最终通过合适的洗脱剂洗脱被测物质，使目标物与样品溶液分离，达到净化、分离、提纯和富集的目的。与液-液提取法相比，磁性固相萃取不使用有毒有害的有机溶剂，无需离心、过滤等步骤，样品处理过程简单，不仅具有省时、高效、快速、成本低、绿色环保等特点，而且易于实现自动化。与传统的固相萃取法相比，磁性固相萃取所使用的吸附剂，具有颗粒比表面积大、萃取操作时间短、吸附剂用量少等优势，且克服了传统固相萃取法的吸附剂装柱耗时、上样操作繁琐费时等缺点。磁性固相萃取已应用于环境污染物分析[13]、药物分析[14]、毒品分析[15]等方面，成为一种发展迅速的新型样品预处理手段，应用前景非常广阔。

基于此，本实验拟采用化学共沉淀法制备磁性固相萃取材料-氨基化磁性碳纳米管，对环境水中13种三嗪类除草剂的提取与富集，并结合液相色谱-质谱联用分析技术，建立环境水中三嗪类除草剂的磁性固相萃取-液相色谱-质谱联用定性、定量分析方法。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用仪（美国Thermo Fisher公司，奥斯汀）；KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，昆山）；HJ-3型数显恒温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司，巩义）；pH-10/100笔式酸度计（上海力辰邦西仪器科技有限公司，上海）；XW-80A型微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器有限公司，上海）；HITACHI-8100型电子显微镜（株式会社日立制作所，东京）；EV7型振动样品磁强计（美国MicroSense公司，尔湾）；Nicolette 5DXB型傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Fisher公司，奥斯汀）；HC-3018型离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，合肥）；BSA 224S-CW型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司，上海）。

13种三嗪类除草剂标准品：2-羟基莠去津、去乙基莠去津、氰草津、脱乙基另丁津、2-羟基特丁津、西玛津、去乙基特丁津、莠去津、环丙津、另丁津、扑灭津、叠氮津、草达津（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，奥格斯堡）。

氨基化多壁碳纳米管（南京先丰纳米材料科技有限公司，南京）；三氯化铁（分析纯）（沈阳市试剂三厂，沈阳）；氯化亚铁（分析纯）（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，天津）；氨水（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）（山东禹王实业有限公司，禹城）；环境水取自沈阳市丁香湖；强力钕铁硼磁铁购于沈阳东北国际五金城；去离子水为美国Milli-Q纯水仪制备。

2.2 仪器条件

色谱条件：液相色谱柱选择Thermo Gold ODS（2.1 mm×150 mm, 5 μm），色谱柱温度设置为35℃，进样体积为10 μL，以0.1 mmol/L乙酸铵-甲酸缓冲溶液（pH=4.5）和甲醇为流动相采用梯度洗脱模式进行洗脱，具体洗脱程序如表1所示，流动相流速为0.20 mL/min。

表1 流动相梯度洗脱程序

质谱条件：选择电喷雾离子化源（ESI），源电压设置为5.00 kV，以正离子模式检测，采用全离子扫描模式，扫描范围设定为m/z 50-500，毛细管温度设置为350℃，雾化气流量设置为30.00 L/min、加热辅助气流量设置分别为8.00L/min，吹扫气流量设置为2.00 L/min。

2.3 磁性碳纳米管的制备

采用化学共沉淀法制备磁性碳纳米管：分别称取1.23 g 氯化亚铁和3.36 g三氯化铁置于烧杯中，加入200 mL去离子水搅拌使其全部溶解。加入0.5 g氨基化多壁碳纳米管，混合均匀后涡旋振荡4 min，使氨基化多壁碳纳米管与四氧化三铁磁性材料充分接触。用氨水（5%）调节溶液至pH＞9，在80℃水浴下用磁力搅拌机搅拌，反应30 min，反应产物用去离子水反复洗涤，直到溶液呈中性。将溶液去除后得到的固体物质放入烘箱，在80℃条件下干燥24h，即得到黑褐色的磁性碳纳米复合材料（Fe3O4/NH2-MWCNTs）。

2.4 磁性固相萃取操作过程

取水样5.0 mL置于试管中，加入10.0 mg Fe3O4/NH2-MWCNTs，在旋振荡仪上振荡提取4 min，静置1 min后，将磁铁靠近试管外壁吸附磁性碳纳米复合材料，弃去溶液；再加入2.0 mL甲醇-水（5:95，v/v）溶液振荡1 min，静置1 min后，将磁铁靠近试管外壁吸附磁性碳纳米复合材料，弃去溶液；将2.0 mL甲醇加入上述吸附目标物的磁性材料中，80 kHz下超声4 min，静置1 min后，将磁铁靠近试管外壁吸附磁性碳纳米复合材料，收集甲醇洗脱液，过0.22 μm滤膜，滤液待检验。

2.5 样品处理

2.5.1 标准溶液配制

准确称取适量的各三嗪类除草剂标准品，分别用甲醇配制成浓度为1.0 μg/mL的标准储备液，置于冰箱中冷冻保存备用。

2.5.2 水样处理

取适量环境水，加入一定量的标准储备液，配制得到实验所需浓度的添加三嗪类除草剂水样，按照“2.4 磁性固相萃取操作过程”进行处理后，供LC-MS检验。

3 结果与讨论

3.1 磁性碳纳米管的制备与表征

磁性碳纳米管的制备方法繁多，常用的主要有共沉淀法[16]、微乳液法[17]、声化学法[18]、溶剂热法[19]、溶胶-凝胶法[20]、高温热解法[21]等。本实验结合现有实验室条件，秉承绿色、环保、成本低，操作简便、安全，产率高，产物稳定等原则，比较分析了化学共沉淀法、高温热解法和溶剂热法的优缺点，最终选择了化学共沉淀法制备磁性碳纳米管。根据三嗪类除草剂的结构特点，比较分析了碳纳米管、羟基化碳纳米管、氨基化碳纳米管、羧基化碳纳米管等的吸附与提取性能，发现氨基化碳纳米管的吸附性能与富集功能均优于其他纳米材料，因此，选择制备了磁性氨基化碳纳米管功能化材料，并将其作为萃取剂用于环境水中三嗪类除草剂的净化、提取与富集。

本实验制备的磁性氨基化碳纳米管微观外貌形态经扫描电镜和投射电镜表征，扫描电镜图和透射电镜图如图1所示，制备的Fe3O4/NH2-MWCNTs材料颗粒平均直径大约为10 nm，近似球形，粒径分布比较均匀，无团聚现象出现。Fe3O4颗粒吸附在碳纳米管的表面，使其具有了磁性。

图1 Fe3O4/NH2-MWCNTs的（a）扫描电镜图和（b）投射电镜图

利用傅立叶变换红外光谱分析制备的Fe3O4/NH2-WCNTs功能化萃取材料，结果如图2所示，制备的材料红外光谱图中出现1个566 cm-1的吸收峰，为Fe3O4的特征吸收峰；出现1个3416 cm-1的吸收峰，为N-H的伸缩振动吸收峰；出现1个2359 cm-1的吸收峰，为CH2键的伸缩振动吸收峰；出现1个1626 cm-1的吸收峰，为C-C键的伸缩振动吸收峰。

图2 Fe3O4/NH2-MWCNTs红外光谱图

采用振动样品磁强计测量该所得材料的磁学性能，结果如图3所示，表明该材料的饱和磁化强度为35 emu/g，拥有超顺磁性，可以满足磁性分离的要求。另外，实验结果还表明，在环境水中Fe3O4/NH2-MWCNTs功能化材料分散性能好，而且在外加磁场作用下能够实现与水溶液的快速、彻底分离，且分离后水溶液保持澄清，加入Fe3O4/AMWNTs的水溶液经磁铁分离前后比较如图4所示。

图3 Fe3O4/NH2-MWCNTs磁滞回线图

图4 加入Fe3O4/AMWNTs的水溶液经磁铁分离前后比较

3.2 磁性固相萃取条件优化

磁性固相萃取材料的吸附性能、净化与富集效果与诸多因素有关，本实验选择的13种三嗪类除草剂结构相近，理化性质近似，故以浓度为0.05 μg/mL的添加莠去津的环境水为样品代表，考察所制备材料的净化、吸附与富集性能，每次水样用量为5 mL，按照“2.4 磁性固相萃取操作过程”处理后进样分析。通过比较水样中莠去津的定量分析结果，综合考察了吸附剂磁性碳纳米管的用量、溶液的pH值、离子强度、萃取时间、淋洗液的种类、洗脱时间、洗脱溶剂种类及用量等因素对目标物的提取效率影响，最终得到环境水中三嗪类除草剂分析的最佳磁性固相萃取条件。

磁性固相萃取中的吸附剂用量对提取效率的影响较大，本实验首先考察了磁性碳纳米管用量的影响，实验结果如图5（a）所示，当磁性碳纳米管用量在2 mg和10 mg之间时，随着吸附剂用量的增加，分析物莠去津的回收率逐渐增大，当磁性碳纳米管用量超过10 mg时，莠去津的回收率不再显著提高。据此选择磁性碳纳米管用量为10 mg，即可满足本实验研究条件下待测物对吸附剂用量的要求。

萃取过程中的提取时间也是影响萃取效率的一个重要因素，本实验考察了提取振荡时间对水样中莠去津提取效率的影响，实验结果如图5（b）所示，提取振荡时间从1 min增加至4 min时，莠去津回收率不断增加，4 min时莠去津的回收率最高，而后随着提取振荡时间的增加，回收率趋于平稳，故选择萃取时间为4 min。

图5 吸附剂用量（a）、萃取时间（b）、溶液pH（c）、离子强度（d）、洗脱溶剂用量（e）、超声时间（f）和淋洗液对（g）环境水中莠去津提取效果的影响

此外，固相萃取过程中，离子强度也会影响目标物的提取效率。本实验通过在样品溶液中加入不同浓度的氯化钠考察了离子强度对莠去津萃取结果的影响，结果如图5（d）所示，在所考察的氯化钠的浓度范围内，目标物的提取效率没有发生显著性变化，因此，选择不添加氯化钠，不改变离子强度。

为了从吸附剂上解吸待测物，磁性固相萃取中需要用洗脱溶剂进行解吸。洗脱溶剂种类繁多[22]，结合三嗪类除草剂理化性质与液相色谱-质谱联用分析方法特点，考察了甲醇、乙腈、乙醇等洗脱溶剂的影响，结果发现3种溶剂对水中莠去津的提取效率基本一致，故选择与流动相更为兼容的甲醇作为洗脱溶剂。另外，洗脱剂的用量也会影响提取效率，考察了甲醇用量对提取效率的影响，实验结果如图5（e）所示。从图5（e）中可以看出，甲醇用量在0.50mL与2.0mL之间时，随着洗脱溶剂用量的增加，莠去津的回收率不断增加；当甲醇用量为2.0 mL时，目标物的回收率最高，随后趋于平稳，故选择洗脱溶剂甲醇的用量为2.0 mL。

在磁性固相萃取方法中，洗脱时间影响前处理效率。本实验使用超声方式洗脱目标物，考察了不同洗脱时间条件下所得到的莠去津回收率，结果如图5（f）所示，洗脱时间在4 min之前，莠去津的回收率不断增加，4 min后趋于平稳状态，故选择超声洗脱时间为4 min。

固相萃取法进行样品净化、提取和富集，为了最大程度地去除样品中的杂质，通常需要在吸附剂吸附目标物后，选择洗脱能力适度的溶液对其进行淋洗。本实验分别选择水、甲醇-水（5:95，v/v）、甲醇-水（10:90，v/v）进行考察，结果如图5（g）所示。结果显示，淋洗液中甲醇含量越高，净化能力越强，当甲醇含量超过10%时，将会影响目标物的提取效率，故选择甲醇-水（5:95，v/v）作为淋洗液，既满足了去除杂质，又不影响目标物的提取效率。

为了考察本实验制备的磁性氨基化碳纳米管的使用寿命和重复利用性能，将磁性纳米材料用甲醇浸泡10小时，放入40℃的烘箱中烘干后，按照“2.4 磁性固相萃取操作过程”处理方法重复利用20次，以莠去津的回收率评价该材料的吸附效率。结果发现，重复利用20次后的待测物回收率平均值为89.75%，这也证明制备的材料可以重复利用，显现出检验成本低、绿色环保的特点。

3.3 方法评价

3.3.1 质谱条件优化

三嗪类除草剂，又称三氮苯类除草剂，以3个C和3个N有序排列的六元环为母体。根据结构中取代基的不同，三嗪类除草剂又分为多种类型，最常见的有莠去津、西草净、西玛津、特丁通、苯嗪草酮等。根据文献[23]相关报道，本实验采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用方法，对选取的2-羟基莠去津、去乙基莠去津、氰草津、脱乙基另丁津、2-羟基特丁津、西玛津、去乙基特丁津、莠去津、环丙津、另丁津、扑灭津、叠氮津、草达津13种三嗪类除草剂分析时，选择正离子（ESI+）检测，全离子扫描模式，得到13种分析物各自的分子离子峰后，再对得到的各自的分子离子进行碰撞诱导解离（CID）分析，得到二级全扫描质谱，选择二级质谱中的主要碎片离子，进行CID分析后得到三级全扫描质谱。根据二级质谱图和三级质谱图特征，确定待分析物的定性和定量分析碎片离子，进一步优化仪器分析相关参数，使其响应值最大，得到13种三嗪类除草剂液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用定性分析和定量分析最优仪器条件。优化仪器分析条件后13种三嗪类除草剂的分子离子峰、定性分析和定量分析质谱主要碎片离子如表2所示。

到杭州之后，李树化很快就出现了钢琴曲创作的一个高潮时期：当年就谱写了钢琴曲《湖上春梦》，1929年完成了钢琴曲《艺术运动》，1930年创作了钢琴曲《林间》。这一年的年底，他完成了献给妻子的钢琴曲《如此温柔》，表达了他对妻子的一往深情和感恩。

表2 13种三嗪类除草剂LC-MS分析保留时间、定性分析和定量分析特征离子

3.3.2 色谱条件优化

液相色谱-质谱联用法分析三嗪类除草剂，可采用反相液相色谱分离模式[24]，可用的流动相种类较多[25]，本实验通过考察甲醇、乙腈和乙酸、氨水等作为流动相时13种三嗪类除草剂的LC-MS分析结果，确定最佳的流动相组成为甲醇-0.1 mmol/L乙酸铵-甲酸缓冲溶液（pH=4.50），根据待测目标物的色谱保留行为差异与色谱峰峰型特征，得到流动相洗脱模式及组成。优化分析实验条件下，13种三嗪类除草剂的液相色谱-质谱联用分析色谱图如图6所示，各自的保留时间如表2所示。由图6可知，在优化的仪器分析实验条件下，13种三嗪类除草剂虽然没有全部达到基线分离，但满足分析要求。因为采用离子阱质谱检测器检测，各目标物的质谱特征性强，利用二级质谱和三级质谱特征碎片离子进行定性分析，二级质谱选择离子流色谱图进行定量分析，相互之间并无干扰。

图6 优化条件下13种三嗪类除草剂的LC-MS分析色谱图

3.3.3 方法学考察

优化实验条件下，对2-羟基莠去津、去乙基莠去津、氰草津、脱乙基另丁津、2-羟基特丁津、西玛津、去乙基特丁津、莠去津、环丙津、另丁津、扑灭津、叠氮津、草达津13种三嗪类除草剂进行液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用分析，得到各自的一级质谱、二级质谱和三级质谱图。液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术可以根据各目标物色谱保留时间和二级质谱、三级质谱特征离子进行定性分析，具有专一性强、可信度高等优点。

配制含有13种三嗪类除草剂的浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL的环境水样，按照“2.4 磁性固相萃取操作过程”方法进行净化、提取和富集操作后，进行LC-MS分析，以环境水中13种三嗪类除草剂的浓度为横坐标（x），测得的色谱峰峰面积为纵坐标（y）绘制工作曲线，拟合得到线性方程、线性范围及相关系数，结果如表3所示。从表3可以看出，所建立的磁性固相萃取-液相色谱-质谱联用分析方法用于环境水中三嗪类除草剂的定量分析，线性范围宽，线性关系良好。

根据环境水中添加浓度为0.005 μg/mL的三嗪类除草剂的测定结果，以相应色谱峰信噪比为3:1时的测定值换算得到所对应的浓度即为检出限（LOD），以信噪比为10:1时的测定值换算得到所对应的浓度即为定量限（LOQ），由此得到环境水中13种三嗪类除草剂分析的LOD和LOQ，结果如表3所示。

表3 环境水中13种三嗪类除草剂的LC-MS分析线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

取含有13种三嗪类除草剂的浓度分别为0.01、0.10、0.50 μg/mL的环境水添加样品溶液，按照“2.4 磁性固相萃取操作过程”方法进行处理后进样分析。在同一日内，每个浓度的样品平行处理3份，根据线性方程测定各目标物含量，按照相应计算公式分别得到日内精密度和回收率，连续提取并测定3日，得到日间精密度，结果如表4所示。

表4 环境水中13种三嗪类除草剂的LC-MS分析精密度和回收率

从表3和表4可见，本实验所建立的检测方法检出限低，准确度和精密度满足相关检验要求，适用于三嗪类除草剂的定性、定量分析。

4 案例应用

2020年10月，XX市XX区XX乡XX村郭XX涉嫌向张XX家水田地喷洒农药，导致五家农户的稻苗全部枯死。利用本实验建立的检测方法，分别在公安机关送检的喷雾器中可疑白色液体和稻田水中检出莠去津成分，其含量分别为3.4μg/mL和0.12μg/mL，检测结果为该案件的认定提供了可靠的理论依据。

5 结论

本实验采用共沉淀法制备了一种可用于样品净化、提取和富集的功能化材料-磁性氨基化碳纳米管，在考察磁性固相萃取影响因素基础上，结合液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术，建立了环境水中13种三嗪类除草剂的磁性固相萃取-液相色谱-质谱联用定性、定量分析方法。实验结果表明，所建立的检测方法操作简便、绿色环保、成本低，检测灵敏、高效、快速，其在相关案件物证鉴定中的成功应用，也充分说明所建立的检测方法能够满足司法鉴定工作的要求，该检测方法实用性强，应用前景广阔。