三子养亲汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠脂质代谢紊乱的调控作用

李怡萍，杨丽丽，郑 昱，周 盐，黄 萍，郑培永，宋海燕*

(1.上海中医药大学附属龙华医院脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中医药大学附属龙华医院脾胃病二科，上海 200032)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)包含了从单纯肝脂肪变到非酒精性脂肪性肝炎的肝脏脂质异常沉积的相关疾病[1]，在成年人发病率为20%～33%，在肥胖人群高达75%[2]。NAFLD与代谢综合征、2型糖尿病互为因果[3]，可进一步引发全身心脑肾血管疾病，已成为影响人类健康的主要慢性肝病之一[4]。由于NAFLD病理机制复杂，且是一种高度异质性疾病，目前临床仍然缺乏明确有效的治疗方法。

肝脏摄取的游离脂肪酸增多，脂肪酸氧化分解减少等造成脂质在肝细胞中过度沉积导致肝细胞发生脂肪变[5]，因此脂质代谢紊乱是NAFLD发生发展的关键环节。研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和沉默调节蛋白1(silent information regulater 1，SIRT1)信号通路是调节肝脏脂质代谢的重要通路，其活化异常是NAFLD发生发展的关键环节之一[6-9]。

三子养亲汤，出自《韩氏医通》，由莱菔子、紫苏子和白芥子三味药组成，具有顺气降逆、化痰消滞的功效[10]。中医学者依据“辨证论治、异病同治”的治疗思想，基于痰湿瘀阻互结、气机郁滞的共同病机，以行气化瘀、痰瘀同治为治疗原则，采用三子养亲汤治疗脂肪肝、高脂血症，取得较好疗效[11-13]，但相关临床试验和动物实验依据未见报道，其作用的生物学机制也不明确。因此本研究拟通过高脂饮食诱导建立NAFLD小鼠模型，观察三子养亲汤干预NAFLD的作用，并基于AMPK/SIRT1对脂质代谢的调控进一步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物与饲料 5周龄SPF级雄性C57BL/6 J小鼠30只，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0005。饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF级动物房，饲养室内温度20～24 ℃，相对湿度45%～65%，昼夜光照12 h/12 h。基础饲料(35%能量来源于脂肪)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，高脂饲料(60%能量来源于脂肪)购自美国Research diet公司。

1.2 药物 三子养亲汤组方药材炒莱菔子(上海虹桥中药饮片有限公司，产地甘肃，批号190618)、炒紫苏子(上海华济药业有限公司，产地浙江，批号2019062903)、炒白芥子(上海华济药业有限公司，产地山东，批号2019062202)，加水煮沸2次，药液过滤并浓缩，于4 ℃保存备用。黄连素(美国Sigma公司，批号SLBB2771V，纯度≥99%)；美能(复方甘草酸苷片，日本米诺发源制药株式会社，批号18125)。

1.3 试剂 AMPK抗体(批号5831)、p-AMPK(批号2535)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)(批号3676)、p-ACC(批号11818)均购自美国Cell Signaling Technology公司；脂酰辅酶A氧化酶1(acyl coenzyme A oxidase 1，ACOX1)(批号00043617)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmityl transferase 1，CPT-1 A)(批号00056856)、β-actin(批号10001832)均购自武汉三鹰生物技术有限公司；SIRT1(英国Abcam公司，批号GR3200692-2)。

1.4 仪器 FastPrep-24型均质器(美国MP Biomedicals公司)；CPA3235型电子天平(德国Sartorius公司)；StepOne Plus型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，SynergyH4型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白电泳转印系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 造模及给药 小鼠适应性喂养1周后，按照体质量随机分为对照组6只，造模组24只。按照文献[14]报道，高脂饮食喂养16周，可导致小鼠肝组织出现明显脂肪变性，胰岛素抵抗等NAFLD相关表征。本实验采用高脂饮食喂养22周，建立NAFLD小鼠模型，对照组给予正常饲料。22周造模完成后造模组根据体质量采用区组随机的方法分为模型组、三子养亲汤组、黄连素组和美能组，每组各6只。三子养亲汤用药剂量依据《中药药理学研究方法学》计算，按照成人临床常规使用剂量进行等效剂量计算得小鼠给药剂量为3.51 g/kg生药量；黄连素剂量依据文献报道及课题组前期实验摸索[15-16]，采用100 mg/kg；美能药物使用剂量按照临床成人使用剂量进行人鼠等效换算为0.35 g/kg。用药组予以相应药物灌胃，对照组及模型组给予生理盐水灌胃，每周记录体质量。药物干预8周后处死，取肝脏称定质量，并收集血清及肝组织样本检测相关指标。

2.2 血脂检测 末次给药12 h后，小鼠禁食12 h，眼球取血，血液静置30 min，常温3 000 r/min 离心15 min，分离得血清。血清送至上海中医药大学附属龙华医院检验科，应用全自动生化仪检测LDL-c、HDL-c、TC、TG水平，所需相关试剂均购自瑞士Roche公司。

2.3 HE染色检测肝组织病理学变化 取5 mm×5 mm小鼠肝组织于4%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，进行脱水、石蜡包埋、切片。将5 μm组织切片按照标准流程进行HE染色，在显微镜下观察并拍照。

2.4 油红O染色检测肝脏脂肪变性程度 取5 mm×5 mm小鼠肝组织，4%中性多聚甲醛溶液中固定，30%蔗糖脱水，OCT包埋后置于-80 ℃冰箱保存备用。制备10 μm肝组织冰冻切片，油红O染液(异丙醇溶解的0.5%油红O储存液，使用前以3∶2加水稀释并过滤)染色10 min，用85%甘油封片，在显微镜下观察并拍照。

2.5 RT-qPCR检测肝组织脂质代谢相关基因的表达 应用Trizol法提取小鼠肝组织RNA，用ABI逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。基因序列通过Blast网上验证，引物由上海闪晶分子生物科技有限公司合成，引物序列见表1。选用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒，在StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统中进行扩增反应，PCR扩增条件为95 ℃ 30 s变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s退火和延伸，重复40个循环。以β-actin为内参，用2-△△CT法分析计算基因相对表达量。

表1 引物序列

2.6 Western blot检测肝组织中脂质代谢相关蛋白的表达 称取肝组织100 mg，加入RIPA裂解液，使用均质器进行组织匀浆，冰上静置30 min后，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA法检测蛋白浓度。取等量蛋白采用10% SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后，加入一抗4 ℃摇床过夜孵育。TBST洗膜后，加入相应二抗，继续室温孵育2 h，应用化学发光法显影。采集条带图片后用图像分析软件Image J分析各条带光密度值，通过目的条带与内参(β-actin)光密度比值进行半定量分析。

3 结果

3.1 三子养亲汤对NAFLD小鼠体质量、肝质量的影响 如图1所示，与对照组比较，模型组小鼠体质量、肝质量升高(P<0.01)；与模型组比较，三子养亲汤组及黄连素组小鼠体质量、肝质量均降低(P<0.05，P<0.01)，美能组小鼠体质量有降低趋势，但差异没有统计学意义(P>0.05)。

注：与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 三子养亲汤对NAFLD小鼠体质量、肝质量的影响

3.2 三子养亲汤对NAFLD小鼠血脂的影响 如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠血清TC、HDL-c、LDL-c水平升高(P<0.01)；与模型组比较，三子养亲汤组、黄连素组及美能组小鼠血清TC、HDL-c、LDL-c水平均降低(P<0.05，P<0.01)；各组TG水平均无明显变化(P>0.05)。

注：与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 三子养亲汤对NAFLD小鼠血脂的影响

3.3 三子养亲汤对NAFLD小鼠肝组织病理的影响 如图3所示，对照组小鼠肝脏结构清晰，肝小叶结构正常，肝细胞呈条索状排列；模型组小鼠肝小叶结构欠清晰，在中央静脉周围弥漫性分布大泡性为主的脂肪变性，伴有炎性细胞浸润，并出现肝细胞气球样变性；与模型组比较，三子养亲汤组、黄连素组小鼠肝组织病理变化得到明显改善，脂肪变性程度显著减轻，无明显炎性细胞浸润灶，美能组小鼠病理变化有所改善，但疗效不明显。

图3 各组小鼠肝组织HE染色(×200)

3.4 三子养亲汤对NAFLD小鼠肝组织脂肪变程度的影响 如图4所示，对照组小鼠肝组织仅见少量红色小脂滴；模型组小鼠肝组织可见弥漫性分布的红色脂滴浸润，脂滴体积较大，部分融合成片；三子养亲汤组小鼠肝组织脂滴含量显著减少，且脂滴体积显著减小。

图4 小鼠肝组织油红O染色(×200)

3.5 三子养亲汤调控AMPK/SIRT1信号通路 如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中AMPK蛋白磷酸化表达和SIRT1 mRNA和蛋白表达均降低(P<0.01)；与模型组比较，三子养亲汤组小鼠AMPK蛋白磷酸化表达和SIRT1 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.01)。

注：A为AMPK、SIRT1蛋白表达；B为SIRT1 mRNA表达。与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。图5 各组小鼠肝组织AMPK、SIRT1的表达

3.6 三子养亲汤对AMPK/SIRT1调控的脂质代谢相关分子表达的影响 如图6A所示，与对照组比较，模型组p-ACC、脂肪酸氧化分子CPT-1 A、ACOX1蛋白表达均降低(P<0.01)；与模型组比较，三子养亲汤组p-ACC、CPT-1 A、ACOX1蛋白表达均升高(P<0.01)。如图6B所示，与对照组比较，模型组PPARα、CPT-1 A、PGC-1α mRNA表达均降低(P<0.01)，FASN mRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，三子养亲汤组PPARα、CPT-1 A、PGC-1α mRNA表达均升高(P<0.05，P<0.01)，FASN mRNA表达降低(P<0.01)。

4 讨论

三子养亲汤是治疗顽固性咳嗽、慢性阻塞性肺炎、慢性支气管炎等肺系病症的经典方[17]，由莱菔子、紫苏子和白芥子3味药组成。方中莱菔子消食导滞，下气祛痰；紫苏子可降气化痰、润肠通便、止咳平喘；白芥子辛温，利气散结祛痰而不耗气。三药相配，共奏顺气降逆，化痰消食之功。临床上根据“异病同治”这一治疗原则，基于痰湿瘀阻互结，气机郁滞的共同病机，使用该方治疗脂肪肝、高脂血症、2型糖尿病等代谢相关性疾病，取得良好疗效[12,18-19]。

本研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠体质量、肝质量增加，肝组织出现弥漫性脂肪变性，血清TC、HDL-c、LDL-c水平均升高。与人类NAFLD患者血清HDL-c水平降低不同，模型组小鼠血清HDL-c水平升高，是由于小鼠在ApoA1(HDL的主要载脂蛋白)的启动子区域缺乏PPAR反应元件所致[20]；与模型组比较，黄连素组、美能组小鼠肝质量、肝组织病理及血脂得到改善，三子养亲汤干预可减轻NAFLD小鼠体质量、肝质量，改善肝组织脂肪变性和炎性细胞浸润，并降低血脂水平，证实三子养亲汤具有改善NAFLD的作用。

脂质代谢紊乱是NAFLD的形成原因之一。AMPK是细胞能量稳态调节器，AMPK被激活后可抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸β氧化[21-22]。AMPK可磷酸化其下游分子ACC，抑制其活性，从而抑制脂肪酸的合成，增加CPT-1 A的活性从而促进脂肪酸β氧化[23]。研究也表明，AMPK可降低FASN的表达，减少脂质的合成，增加PPARα、ACOX1、PGC-1α的表达，促进脂肪酸氧化[24-26]。SIRT1是NAD+依赖的去乙酰化酶[27]，与AMPK的活化相互促进，共同调节细胞内脂质代谢[28-29]。本研究显示，与对照组比较，模型组AMPK磷酸化、SIRT1表达均降低，三子养亲汤组其表达升高。并且，NAFLD模型组失活的ACC表达降低，促进脂肪酸氧化基因CPT-1A、ACOX1、PPARα、PGC-1α的表达降低，促进脂肪酸合成的FASN表达上调，药物干预可上调p-ACC、CPT-1 A、ACOX1、PPARα、PGC-1α的表达，降低FASN的表达，提示三子养亲汤可能通过调控AMPK/SIRT1调控脂质代谢相关分子信号通路，从而发挥改善肝细胞脂质代谢的作用。

注：与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。图6 各组小鼠肝组织中脂质代谢相关分子的表达

综上所述，本研究结果表明，三子养亲汤可改善NAFLD，其作用机制可能与促进AMPK/SIRT1信号通路活化调控脂质代谢紊乱有关，本研究为该经典方剂治疗脂肪肝的临床应用提供实验依据。