Hsa-circ-0006089在胃癌组织中的表达及其临床意义

徐其轩，姚一舟，朱新国

（苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006）

胃癌是2018年全球第三大常见恶性肿瘤，也是死亡率最高的消化道肿瘤，死亡人数超过78.2万 人[1]。由于胃癌患者缺乏明显的不适症状和早期诊断指标，大多数病例确诊时已为进展期或晚期[2]。目前胃癌的治疗主要依赖于手术治疗，但手术有肿瘤细胞残留的风险，并且进展期或者晚期患者通常丧失手术机会，而化疗在杀灭胃癌细胞的同时对机体正常细胞损伤也较大。

近年来肿瘤标记物开始在恶性肿瘤的诊断及评估预后中发挥越来越重要的作用，因此有必要在胃癌中找出新的肿瘤标记物，以期早期诊断胃癌并评估胃癌患者预后，为胃癌患者的诊疗提供新思路。

环状RNA（circularRNA）是一类新的非编码RNA，通过3'和5'端之间的共价键反向剪切而形成[3]。多年以前它们被认为是基因重排和剪接的毫无作用的副产物。然而，随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的发展，近年来的研究表明，环状RNA总体上是稳定、保守、低表达的，其表达水平在不同的细胞和组织中存在差异，这也使得环状RNA作为恶性肿瘤的诊断标记物成为可能。

此外，环状RNA具有多种功能，如作为microRNA（miRNA）海绵竞争性结合microRNA、与RNA结合蛋白结合、参与蛋白质的翻译等[4]。近年来，一些环状RNA在胃癌中的作用得到了进一步的研究。例如，circDONSON通过激活SOX4信号促进胃癌细胞的增殖与转移[5]；circRNA-100269通过与miR-63011结合抑制胃癌细胞增殖和生长[6]；circ-SFMBt2在胃癌组织中表达上调同时促进胃癌细胞的增殖[7]。这些研究表明，一些环状RNA在胃癌的发生、发展中发挥了重要作用，是胃癌潜在的分子标志物。然而，更多的环状RNA在胃癌中的表达及其临床意义有待进一步研究。

在本研究中，我们通过G E O数据库GSE83521筛选出在胃癌组织中显著高表达的hsacirc-0006089。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术在70 例临床组织标本中进行验证，并分析hsacirc-0006089的表达与胃癌临床病理特征及患者预后的相关性。

1 材料和方法

1.1 资料收集 在GEO数据库中检索“环状RNA 胃癌”，选择GSE83521数据集。利用GEO2R在线工具对GSE83521数据集进行差异分析，选取hsacirc-0006089做后续研究。利用miRbase网站预测hsa-circ-0006089结合的miRNA，利用Targetscan网站预测miRNA下游靶基因。收集2010年—2012年在我院行手术治疗的胃癌患者的肿瘤及癌旁正常组织标本，所有患者手术前均未行放化疗。

1.2 富集分析 GO富集分析从生物学过程、细胞组成和分子功能三方面分析hsa-circ-0006089下游基因的生物学特性。利用KEGG富集分析对hsacirc-0006089下游靶基因进行通路分析，寻找可能的生物学通路。GO和KEGG富集分析利用R软件完成，P＜0.05认为差异有统计学意义。

1.3 qPCR 使用Trizol试剂提取胃癌组织及癌旁正常组织标本总RNA，经NanoDrop ND1000 仪测定RNA浓度，使用HiScript®Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）试剂盒逆转录RNA，使用TB Green®Premix Ex Taq™ Ⅱ试剂盒进行PCR反应。以GAPDH作为内参，环状RNA的相对表达量用2-△△Ct表示，其中△Ct＝CtcircRNACtGAPDH。以上实验重复3 次。

1.4 统计分析 采用R软件4.0.1和SPSS 18.0软件进行统计分析。根据hsa-circ-0006089表达的中位数将胃癌患者分为两组（hsa-circ-0006089高表达组，n＝34；hsa-circ-0006089低表达组，n＝36）。采用t检验行两组间比较。运用卡方检验分析临床病理特征与hsa-circ-0006089表达量的关系。采用Kaplan-Meier法评估胃癌患者的预后。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hsa-circ-0006089是一个与胃癌有关的环状RNA利用GEO2R在线工具分析GEO数据库GSE83521，使用R软件绘制该数据库表达的火山图（图1A）和差异基因表达热图（图1B）。Hsa-circ-0006089在胃癌组织中表达显著高于癌旁正常组织，因此选定该基因做进一步研究。利用miRbase和Targetscan数据库预测hsa-circ-0006089的下游基因，并进行GO和KEGG分析。GO分析显示hsa-circ-0006089与MAPK通路的激活有关（图1C），KEGG分析显示hsa-circ-0006089与胃酸分泌及癌症中的蛋白多糖有关（图1D）。

图1 Hsa-circ-0006089在胃癌组织中的表达及功能。A：GSE83521数据库中所有环状RNA表达的火山图。差异基因显著性的截断值标准为P＜0.05，log2倍数绝对值变化＞1。B：差异环状RNA表达的热图。C：Hsa-circ-0006089下游基因GO富集分析。D：Hsa-circ-0006089下游基因KEGG富集分析。

2.2 胃癌及癌旁正常组织中hsa-circ-0006089的表达 我们选择70 对胃癌及癌旁正常组织标本，利用qPCR技术检测所有标本中hsa-circ-0006089的表达水平。结果如图2A所示，hsa-circ-0006089在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P＜0.001）。并且亚组分析显示，在有淋巴结转移的患者中，胃癌组织中的hsa-circ-0006089表达高于无淋巴结转移患者（P＜0.01）（图2B）；在T分期为1-2期的患者中，胃癌组织中的hsa-circ-0006089表达高于T分期为3-4期的患者（P＜0.05）（图2C）；在TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期的患者中，胃癌组织中的hsa-circ-0006089表达高于TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期的患者 （P＜0.01）（图2D）。

图2 胃癌组织标本中hsa-circ-0006089的表达。A：Hsa-circ-0006089在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达。B：有淋巴结转移和无淋巴结转移的患者胃癌组织标本中hsa-circ-0006089的表达。C：T1-2期和T3-4期患者胃癌组织标本中hsa-circ-0006089的表达。D：TNM Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期患者胃癌组织标本中hsa-circ-0006089的表达。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.3 胃癌组织中hsa-circ-0006089的表达与患者临床病理特征的关系 我们将70 例胃癌患者分为hsacirc-0006089高表达组（n＝34）和低表达组（n＝36），结果如表1所示。Hsa-circ-0006089在胃癌组织中的表达与淋巴结转移和TNM分期呈正相关，而与患者年龄、性别、肿瘤大小、T分期、病理分级、脉管是否侵犯及神经是否侵犯无关。

表1 Hsa-circ-0006089表达与胃癌患者临床病理特征的关系（例）

2.4 胃癌患者组织标本中hsa-circ-0006089的表达与患者预后的相关性分析 Kaplan-Meier分析结果表明hsa-circ-0006089高表达的患者的总生存期比hsacirc-0006089低表达的患者的总生存期更短（P＝0.01）（图3）。此结果提示hsa-circ-0006089可能作为胃癌患者预测预后的重要标记物。

图3 根据hsa-circ-0006089表达水平分组，Kaplan-Meier分析70 例胃癌患者的总生存期。

3 讨论

随着近些年RNA二代测序技术和生物信息学分析的快速发展和广泛应用，环状RNA的丰度和多样性被鉴定出来，环状RNA已成为癌症研究领域的热点[8]。许多环状RNA已经被学者证明在许多人类癌症中作为癌基因或肿瘤抑制基因，如肺癌、结肠癌和肝癌[9]。此外，一些环状RNA也被报道与胃癌相关。例如，circ-DLST[10]和circ-CACTIN[11]在胃癌组织中均高表达，可以作为胃癌患者诊断及预测预后的标志物。但是目前尚无针对hsa-circ-0006089与胃癌的有关研究。

胃癌早期患者多无明显症状，而当前比较常用的肿瘤标记物，如癌胚抗原CEA，糖类抗原CA-199，CA-125等特异性较低，假阴性率较高，很难适用于胃癌患者的早期诊断，大多数患者有明显症状时已经为进展期或者晚期，所以如何提高胃癌患者早期诊断率从而改善胃癌患者预后非常关键。研究显示，环状RNA在哺乳动物中广泛存在，在组织及外周血中均存在一定丰度的较为稳定的环状RNA。组织中环状RNA表达水平在不同疾病之间存在差异性，检测准确率较蛋白质标志物高，且异常表达更早出现，利于胃癌患者早期诊断[9]。综上，环状RNA由于其稳定、高表达的特性而可以作为恶性肿瘤的诊断标记物。

在本研究中，我们首先通过生物信息学分析找到了胃癌组织中高表达的环状RNA：hsacirc-0006089，并通过功能富集分析发现hsacirc-0006089与恶性肿瘤及MAPK通路有关。后续利用qPCR技术在70 例胃癌患者的肿瘤及癌旁组织标本中进行验证，并将其表达水平与患者临床病理特征进行相关性分析，结果发现hsa-circ-0006089在胃癌组织中显著上调，并与淋巴结转移、TNM分期和胃癌患者的总生存期相关。综上所述，我们的研究结果表明，hsa-circ-0006089可以作为胃癌患者诊断和评估预后新的生物标志物。

MAPK通路是参与多种癌症和其他人类疾病的关键信号通路[12]。最近，越来越多的文章显示环状RNA与MAPK通路密切相关。例如，hsa-circ-0003204通过调控MAPK信号通路促进宫颈癌发生[13]。我们的研究结果显示，通过对hsacirc-0006089的下游靶基因进行功能富集分析，我们发现hsa-circ-0006089可以激活MAPK通路，这对我们研究hsa-circ-0006089如何调控胃癌的发生、发展提供了新思路，同时也使得hsa-circ-0006089作为胃癌靶向治疗的潜在靶点成为可能。

本研究中仍然存在一些不足：(1)纳入样本量相对较小，可能致使统计学效能较少；(2)本研究未能检测胃癌患者外周循环血中hsa-circ-0006089的表达；(3)未能对hsa-circ-0006089调控胃癌发生、发展的具体机制进行深入研究。

综上所述，在胃癌中hsa-circ-0006089高表达与胃癌的进展及不良预后有关，并可能通过MAPK通路促进胃癌的发生、发展。Hsa-circ-0006089可作为辅助诊断和预后判断的生物标记物，未来可考虑进一步扩大样本量并深入探究hsa-circ-0006089对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。