水族抗痹证药酒抗类风湿性关节炎的实验研究

吉杨丹 帅 敏 吴 倩 梁子聪 王 恒 臧贵勇*

1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558003；2.黔南州人民医院，贵州 都匀 558000

类风湿关节炎( rheumatoid arthritis，RA) 是临床上一种致残性很高的疾病，其病理表现为滑膜炎性增生、关节软骨破坏、关节间隙变窄，晚期可出现关节周围肌肉萎缩及关节僵硬变形[1-3]。中药治疗RA在临床应用上已有较大的突破，其中雷公藤、祖师麻、青枫藤、白芍等有效成分亦被生产成中药制剂用于临床治疗[4]。然而挖掘及开发更多中药、民族药抗RA制剂也成为目前热门的课题。本方搜集于三都水族民族地区民间，其被应用治疗类风湿关节炎、痛风、骨关节炎已有基础，而且临床效果较好。课题组前期已经就该药酒就急性毒性实验进行了研究并已发表相关论文。本实验建立大鼠类风湿关节炎模型，以不同浓度水族抗痹证药酒方灌胃干预，观察其是否具有治疗RA的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒购自北京诚林生物公司，弗氏完全佐剂购于美国Sigma公司。显微镜 E200型(日本尼康)，酶标仪MR-96A型(深圳迈瑞)等。

1.2 药酒的制备 由刺五加、雷公藤、黑骨藤、楤木等按一定比例用53度白酒浸泡3个月以上。

1.3 实验动物与分组 清洁级SD雌性大白鼠50只，体质重(200±20)g，分笼饲养。造模前用数字随机法将大鼠其分成模型组，空白对照组，抗痹证药酒高、中、低剂量治疗组，每组10 只。

1.4 建模及灌胃 佐剂性关节炎建模[5]取羊毛脂16 g与液体石蜡(72 mL)加温后置于研钵中，然后将卡介苗等体积滴加入研钵(逐滴加入)，充分研磨均匀后配制成CFA，并分装至1.5 mL EP管中。除空白组外，其余各组大鼠用75%酒精对大鼠右足趾进行消毒，将CFA 0.15 mL注射于大鼠右足趾皮下，空白组不作任何处理。建模成功后，水族抗痹证药酒高、中、低剂量组分别给 5 mL/kg、2.5 mL/kg、1.25 mL/kg抗痹证药酒提取物灌胃，空白组及模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每天 1次，持续2周。

1.5 指标检测

1.5.1 大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α的含量测定 造模第14天，末次给药1 h后，股动脉取血，静置，离心，取上清液，在-20 ℃下保存待测。白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α的含量采用ELISA法测定，按照试剂盒说明书操作。

1.5.2 病理组织形态学检查 取右踝关节组织标本于4%甲醛溶液固定，脱钙，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜镜检观察。

2 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件进行，计量资料以均数加减标准差表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量测定的结果 与空白组比较，模型组大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量均明显升高(P<0.05)。与模型组比较，抗痹证药酒不同剂量组大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量均有不同程度下降，其中高剂量组血清白介素1-β含量，中剂量组和高剂量组血清白介素6含量，低剂量组、中剂量组、高剂量组血清肿瘤坏死因子-α含量比较具有显著性差异(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血清白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α的结果比较

3.2 各组大鼠踝关节病理切片观察结果 正常组(图1 A)关节滑膜结构层次分明，细胞排列整齐，关节软骨及骨质未见破坏；模型组(图1 B)足关节滑膜见明显充血、水肿，血管翳形成，滑膜可见大量淋巴细胞、浆细胞浸润，关节软骨轻度破坏；与模型组相比，水族抗痹证药酒不同剂量组(图1 C、图1 D、图1 E)大鼠关节滑膜充血、水肿情况有不同程度减轻，淋巴细胞、浆细胞浸润情况相对减轻；与低中剂量组比较，高剂量组滑膜充血、水肿情况以及淋巴细胞、浆细胞等炎细胞浸润最轻。

4 讨论

RA发病机制复杂，炎性介质作用是其发病的主要因素。而白介素-1β、白介素6、肿瘤坏死因子-α是现今发现参与其致炎过程的主要促炎因子之一[2-3，6]。目前在白介素-1家族中有多个成员，其中白介素-1β是通过激活单核-巨噬细胞、B细胞和T细胞参与RA的致炎过程。白介素-1β的主要作用是抑制骨和软骨的修复，在RA致病过程中是导致骨和软骨破坏的关键细胞因子[7]。研究[8]表明，肿瘤坏死因子-α比白介素-1β更具有致炎作用，高水平的肿瘤坏死因子-α除了参与RA关节破坏和滑膜炎症外，还与肉芽肿样滑膜炎产生相关。肿瘤坏死因子-α和白介素-1β两种细胞因子之间虽然作用不同，但相互调节，抑制糖蛋白和胶原合成，影响软骨的修复，加快骨质破坏[9]。白介素6由滑膜细胞产生的，是RA关节炎症中的重要炎症介质。它虽不直接参与滑膜增生和关节软骨破坏，但它是肿瘤坏死因子-α和白介素-1β等炎症因子的效应因子，具有炎症放大器的作用[10]。

大鼠注射佐剂后，关节可出现红肿热痛、功能障碍等炎症表现，血清炎症因子增高，关节滑膜增厚，炎细胞浸润等病理表现，与RA患者的临床表现十分相似，所以佐剂性关节炎模型是一种公认的类风湿性关节炎模型制作方法[5]。本实验血清炎症因子检测结果显示，与模型组比较，抗痹证药酒组大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量均有不同程度下降，而高剂量组血清白介素1-β含量、中高剂量组血清白介素6含量和低中高剂量组血清肿瘤坏死因子-α含量比较，具有显著性差异(P<0.05)。踝关节镜下病理观察可见，与模型组相比，水族抗痹证药酒不同剂量组(图1 C、图1 D、图1 E)大鼠关节滑膜充血、水肿情况有不同程度减轻，淋巴细胞、浆细胞浸润情况相对减轻；与低中剂量组比较，高剂量组滑膜充血、水肿情况，淋巴细胞、浆细胞浸润情况最轻。证实抗痹证药酒不同剂量组均具有佐剂性关节炎大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量的作用，从而减轻关节滑膜炎症，关节软骨、骨质破坏。水族抗痹证药酒在抑制大鼠RA模型炎症因子方面效果显著，但其作用机制还有进一步挖掘的价值。本实验证实了该方具有抗RA的效果，为今后民族方药开发与利用奠定了理论基础。