金雀花根水提物和乙醇提取物对小鼠高尿酸血症的影响Δ

赵俊杰，张金娟，张春雷，朱勤凤，廖尚高#（.贵州医科大学药学院，贵阳 550025；2.贵州医科大学附属医院药剂科，贵阳 550002；.贵州医科大学基础医学院，贵阳 550025）

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是由于体内尿酸分泌过多或排泄不足而引起的，现已被证实是引起痛风、肾功能不全、高血压、高脂血症、糖尿病和肥胖等症的关键因素[1]。早期预防和治疗HUA 对上述疾病的预防具有重要意义。尿酸是黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）氧化黄嘌呤和次黄嘌呤产生的代谢产物。XOD长期过量产生尿酸和/或肾脏排泄尿酸不足可能导致HUA 和尿酸钠晶体沉积。目前治疗HUA 的化学药主要有2类：一类是减少尿酸过量生成类药物，如别嘌醇和非布索坦等；另一类是促进尿酸排泄类药物，如苯溴马隆和丙磺舒等[2]。这2 类药物虽疗效尚可，但靶点较单一、副作用较大，患者的耐受性、依从性均较差[3－4]。

金雀花根又名锦鸡儿根、阳雀花根，是豆科植物锦鸡儿Caragana sinica（Buc’hoz）Rehd.的根，主要分布在我国河北、陕西、江苏、四川、云南等地，具有补肺健脾、活血祛风的功效，临床上主要用于风湿骨痛、痛风、肺虚、久咳等症的治疗[5]。本课题组前期考察了27种中草药的醇提物和水提物对XOD 的抑制活性，发现金雀花根水提物（water extract ofC.sinica，WCS）及乙醇提取物（ethanol extract ofC.sinica，ECS）具有显著的XOD抑制活性[6]。本研究采用氧嗪酸钾联合次黄嘌呤建立HUA小鼠模型，研究WCS及ECS对HUA模型小鼠尿酸生成和排泄的影响，初步探讨其可能机制，以期为抗HUA药物的研发提供理论依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括ELX815型全波长扫描式多功能读数仪（美国Bio-Tek 公司）、5200 型全自动化学发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）、P50002F型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、BS223S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]、KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、ZYCGF-Ⅱ-10T 型超纯水机（四川卓越水处理设备有限公司）、TGL16M型台式低速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、DYY-6C 型电泳仪（北京六一仪器厂）、ECLIPSE E100型正置光学显微镜（日本Nikon公司）等。

1.2 主要药品与试剂

金雀花根药材于2020 年9 月采自河北省保定市定州市，经贵州医科大学标本馆馆长龙庆德教授鉴定为豆科植物锦鸡儿C.sinica（Buc’hoz）Rehd.的根，标本存放在贵州医科大学天然药物化学教研室（标本号202009）。别嘌醇、苯溴马隆、次黄嘌呤、氧嗪酸钾（批号分别为L2001089、L2010564、L2007066、D0901A，纯度均大于98%）和高效RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳制备试剂盒、彩虹180广谱蛋白Marker、HRP Substrate Peroxide Solution超敏发光液、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗（批号分别为R0010、PC0020、P1200、PR1910、PE0010、G202117）均购自北京索莱宝科技有限公司；XOD 测定试剂盒（比色法）、血清尿酸（serum uric acid，SUA）测定试剂盒（微板法）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）测定试剂盒（微板法）、肌酐测定试剂盒（微板法）（批号分别为A002-1-1、20191011、20190907、20190916）均购自南京建成生物工程研究所；小鼠源葡萄糖转运蛋白9（glucose transporter 9，GLUT9）、尿酸盐转运蛋白1（urate transporter 1，URAT1）、有机阴离子转运蛋白1（organic anion transporter 1，OAT1）单克隆抗体（批号分别为14937-1-AP、NBP1-05054、ab135924）均购自上海优宁维生物科技股份有限公司；小鼠源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体（批号T0004）购自美国Affinity 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批号P2938）购自德国Merck 公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为超纯水。

1.3 动物

SPF级雄性昆明种小鼠，100只，体质量18～22 g，由贵州医科大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（黔）2018-0001。小鼠饲养环境通风良好，温度18～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h 光照昼夜循环。本实验通过贵州医科大学实验动物伦理委员会审批（编号2000069）。

2 方法

2.1 WCS与ECS的制备

分别称取金雀花根2 kg，加16 L水煎煮提取或16 L 75%乙醇回流提取，均提取2 h，再同法提取1 h，过滤，合并相应的滤液，减压浓缩为浸膏，得WCS 400 g、ECS 519 g，备用。

2.2 分组、建模与给药

小鼠适应性饲养1 周后，按体质量随机分为正常对照组、模型组、别嘌醇组（阳性对照，5 mg/kg[7]）、苯溴马隆组（阳性对照，7.8 mg/kg[8]）和WCS 低、中、高剂量组（38、75、150 mg/kg，根据临床常用剂量的0.5、1、2 倍换算）以及ECS低、中、高剂量组（50、100、200 mg/kg，根据临床常用剂量的0.5、1、2倍换算），每组10只。除正常对照组小鼠腹腔注射和灌胃等体积生理盐水外，其余各组小鼠于每天早上9：00 腹腔注射氧嗪酸钾100 mg/kg 联合灌胃次黄嘌呤500 mg/kg，连续7 d，建立HUA 模型[7]。从建模第3 天起，各给药组小鼠于建模给药后1 h分别灌胃相应药物，正常对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续5 d。

2.3 取样与体质量、脏器指数分析

分别称定各组小鼠建模给药第1、3、5、7 天的体质量。末次给药前，禁食不禁水24 h，末次给药1 h后小鼠眼眶取血，室温静置2 h，以3 500 r/min离心15 min，取血清，于－20 ℃中保存备用。采血后脱颈椎处死小鼠，剖取内脏，称定质量，计算肝、肾和脾的脏器指数[脏器指数＝脏器质量（g）/体质量（g）×100%]。然后快速将一部分肾组织固定于4%多聚甲醛中保存备用，另一部分肾组织与肝组织于－80 ℃中保存备用。

2.4 血清中生化指标和肝组织中XOD活性检测

取各组小鼠血清适量，按照试剂盒说明书操作，检测XOD 活性和SUA、BUN、血肌酐（serum creatinine，SCR）含量。另取各组小鼠肝组织100 mg，加入生理盐水制成10%的匀浆液，以2 500 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书操作，检测XOD活性。

2.5 肝组织中XOD mRNA表达检测

采用实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法检测。取各组3只小鼠的冻存肝组织，研磨后，转移至1.5 mL 预冷的EP 管中，裂解组织后，抽提RNA，逆转录合成cDNA，然后取1 μL 逆转录产物进行PCR检测。PCR的反应总体系为Takara SYBR Premix Ex Tap 10 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.2 μL，cDNA 2 μL，用ddH2O补至20 μL。反应条件如下：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环。以GAPDH为参照，采用2－ΔΔCt法计算各组小鼠肝组织中XOD mRNA的相对表达量。引物序列和产物长度见表1。

表1 PCR引物序列和产物长度

2.6 肝组织中XOD 蛋白和肾组织中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表达检测

采用Western blot 法检测。分别称取各组3 只小鼠的冻存肝组织与肾组织样本各100 mg，加RIPA 组织裂解液1 mL，于冰上研磨成匀浆，于4 ℃以12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用BCA 法测定蛋白浓度。取蛋白终浓度为1 μg/μL的样本上样15 μL，加入5×蛋白上样缓冲液，于100 ℃加热5 min变性，然后进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V 电泳至Marker 红色条带出现，转换电压120 V 至电泳结束。采用湿转法将蛋白转到PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉将膜在室温下封闭1.5 h，用TBST 缓冲液清洗3 次，每次10 min，分别加入XOD、GLUT9、URAT1、OAT1、GAPDH 一抗（目标蛋白稀释比例均为1∶1 000，内参蛋白稀释比例均为1∶3 000），4℃孵育过夜；用TBST缓冲液清洗3 次，每次10 min，加入二抗（稀释比例为1∶3 000），室温孵育1 h，用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，显影成像。采用Image J 1.8.0 软件分析条带的灰度值，以目标蛋白灰度值与内参蛋白（GAPDH）灰度值的比值评价蛋白的相对表达量。

2.7 肾组织病理学观察

取4%多聚甲醛固定的肾组织，乙醇脱水、石蜡包埋、切片，经苏木精-伊红染色后，于正置光学显微镜下观察肾组织的病理学变化。

2.8 统计学分析

所有数据均用SPSS 19.0 软件进行统计分析，数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 WCS和ECS对HUA模型小鼠体质量的影响

如表2所示，与正常对照组比较，别嘌醇组小鼠建模给药第3、5、7天的体质量均显著降低（P＜0.01），其余各给药组小鼠体质量的差异无统计学意义（P＞0.05），表明别嘌醇可抑制小鼠体质量的自然增长，WCS 和ECS对小鼠体质量的增长没有影响。

表2 WCS和ECS对HUA模型小鼠体质量的影响（，n＝10，g）

表2 WCS和ECS对HUA模型小鼠体质量的影响（，n＝10，g）

a：与正常对照组比较，P＜0.05

3.2 WCS和ECS对HUA模型小鼠脏器指数的影响

如表3 所示，各组小鼠的肝脏指数和脾脏指数的差异均无统计学意义（P＞0.05），表明WCS 和ECS 对小鼠肝脏和脾脏无明显影响。与正常对照组比较，模型组和别嘌醇组小鼠的肾脏指数均显著升高（P＜0.05），表明建模剂（氧嗪酸钾、次黄嘌呤）以及阳性药物别嘌醇对小鼠肾脏有毒副作用。与模型组比较，WCS 和ECS 各剂量组小鼠的肾脏指数均显著降低（P＜0.05），表明WCS和ECS能减轻由建模剂引起的肾损伤。

表3 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠脏器指数的影响（，n＝10，%）

表3 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠脏器指数的影响（，n＝10，%）

a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05

3.3 WCS和ECS对HUA模型小鼠SUA、BUN、SCR含量的影响

如表4 所示，与正常对照组比较，模型组小鼠SUA含量显著升高（P＜0.05），表明HUA 小鼠模型建立成功。与模型组比较，各给药组小鼠SUA含量均显著降低（P＜0.05），表明WCS和ECS均具有抗HUA活性。与正常对照组比较，别嘌醇组小鼠BUN、SCR 含量均显著升高（P＜0.05），其余各给药组小鼠BUN、SCR含量差异均无统计学意义（P＞0.05），表明别嘌醇可能会损伤肾功能，WCS和ECS对小鼠肾功能无明显影响。

表4 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠SUA、BUN、SCR含量的影响（，n＝10）

表4 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠SUA、BUN、SCR含量的影响（，n＝10）

a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05

3.4 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠血清和肝组织中XOD活性的影响

如表5所示，与正常对照组比较，模型组小鼠血清和肝组织中XOD活性均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组小鼠血清、肝组织中XOD活性均显著降低（P＜0.05），表明WCS和ECS能抑制HUA模型小鼠血清和肝组织中XOD活性。

表5 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠血清和肝组织中XOD活性的影响（，n＝10）

表5 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠血清和肝组织中XOD活性的影响（，n＝10）

a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05

3.5 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠肝组织中XOD mRNA和蛋白表达的影响

如图1和表6所示，与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织中XOD mRNA和蛋白的相对表达量均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组小鼠肝组织中XOD mRNA、蛋白的相对表达量均显著降低（P＜0.05），表明WCS 和ECS 可能通过下调XOD 的表达来发挥抗HUA作用。

表6 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠肝组织中XOD mRNA和蛋白表达的影响（，n＝3）

表6 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠肝组织中XOD mRNA和蛋白表达的影响（，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05

图1 各组小鼠肝组织中XOD蛋白表达的电泳图

3.6 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠肾组织中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表达的影响

如图2和表7所示，与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中GLUT9、URAT1 蛋白的相对表达量均显著升高（P＜0.05），OAT1 蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，苯溴马隆组和ECS 高剂量组小鼠肾组织中GLUT9蛋白的相对表达量以及各给药组小鼠肾组织中URAT1蛋白的相对表达量均显著降低（P＜0.05），苯溴马隆组和WCS低、高剂量组以及ECS低剂量组小鼠肾组织中OAT1 蛋白的相对表达量均显著升高（P＜0.05），表明WCS和ECS抗HUA作用的机制可能与下调URAT1表达有关。

图2 各组小鼠肾组织中GLUT9、URAT1、OAT1 蛋白表达的电泳图

表7 WCS和ECS对HUA模型小鼠肾组织中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表达的影响（，n＝3）

表7 WCS和ECS对HUA模型小鼠肾组织中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表达的影响（，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05

3.7 WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠肾组织病理变化的影响

如图3所示，正常对照组小鼠肾小管边界清晰，上皮细胞排列整齐；模型组小鼠出现肾小管间质病变，以肾小管扩张和轻度肾水肿为特征；别嘌醇组小鼠出现重度肾水肿和肾小管严重扩张；苯溴马隆组小鼠出现肾小管轻度扩张和轻度肾水肿。与模型组小鼠比较，WCS 和ECS各剂量组小鼠的肾小管扩张均有所减轻，肾水肿程度均明显减轻，其中WCS 高剂量组和ECS 高剂量组小鼠已恢复到正常水平，表明WCS 和ECS 可在不同程度上改善HUA模型小鼠的肾损伤状态。

图3 WCS和ECS对HUA模型小鼠肾组织病理变化的影响（×200）

4 讨论

氧嗪酸钾是选择性竞争性尿酸酶抑制剂，次黄嘌呤是尿酸代谢产物的前体。已有研究报道，上述2种药物联合使用可使小鼠体内尿酸含量上升并减少尿酸的排泄量[9]。本研究通过腹腔注射氧嗪酸钾联合灌胃次黄嘌呤成功建立了HUA小鼠模型。

XOD是一种分布于脏器和血管的钼羟化酶，为还原酶的一种，能催化次黄嘌呤与黄嘌呤产生尿酸。当嘌呤代谢紊乱时，可使患者血清中XOD水平增加，进而导致体内尿酸增加。正常机体中，尿酸多从肾脏排泄；当尿酸水平过高或肾功能低下时，易导致尿酸积聚在各脏腑和关节中，引发HUA 或痛风性关节炎，因此抑制XOD活性或改善肾功能是治疗HUA 的主要途径[10]。本研究结果显示，与模型组比较，WCS和ECS各剂量组小鼠体内的SUA含量、XOD活性以及XOD mRNA和蛋白的相对表达量均明显降低，表明WCS 和ECS 通过抑制XOD的活性，下调其mRNA和蛋白的表达，从而降低HUA模型小鼠体内SUA含量。

肾脏指数、BUN 和SCR 是检测肾功能的灵敏指标[11]。本研究结果显示，与模型组比较，WCS 和ECS 可降低小鼠肾脏指数和血清中SUA含量，改善肾小管间质病变，减轻肾小管扩张和肾水肿程度，表明WCS和ECS对HUA模型小鼠肾功能损伤具有一定的改善作用。

据研究报道，尿酸转运蛋白是促尿酸排泄药物的主要作用靶点，临床上约90%的HUA 是由肾尿酸排泄不足而产生[12]。GLUT9与URAT1是尿酸盐在肾小管重吸收的主要转运体；OAT1是尿酸排泄的转运体，其作用是将尿酸从血液吸收到细胞内肾小管细胞[13－14]。抑制URAT1 和GLUT9 转运体的表达以及促进OAT1 转运体的表达是降低体内尿酸的有效方式[15－16]。本研究结果显示，与模型组比较，WCS和ECS对HUA模型小鼠肾组织中OAT1和GLUT9的表达影响不显著，但可明显下调URAT1 的表达，表明WCS 和ECS 可能是通过减少肾脏对尿酸的重吸收来调节HUA 模型小鼠体内的尿酸水平。

综上所述，WCS 和ECS 能够显著降低HUA 模型小鼠SUA 含量，改善其肾脏的病理状态，其作用机制可能与抑制XOD 活性和尿酸重吸收、下调XOD 蛋白和mRNA 表达有关。本研究仅为WCS 和ECS 对HUA 模型小鼠药效机制的初步验证，HUA的病理机制还与炎症因子、免疫等因素密切相关，本课题组会继续探究WCS和ECS 对HUA 干预的机制，为临床寻找新型降尿酸药提供有效的数据支撑。