白细胞介素-4 在脂多糖诱导急性肺损伤模型中的保护作用

赵 琨 ，肖云 ，杨纯 ，严志凌 ，董敏娜 ，向柄全 ，肖茗耀

（1）昆明医科大学第三附属医院重症医学科;2）妇瘤科，云南 昆明 650118;3）昆明医科大学第一附属医院急诊医学部，云南 昆明 650032）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是肺内外的各种病因导致的急性低氧性呼吸功能不全综合症，其严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），大量炎症因子的激活是ALI 发展为ARDS 的主要机制，因此，调节炎症和凋亡可能是治疗ALI 的新方案[1]。有研究[2]认为，模式识别受体可以启动炎症信号级联反应和促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和 IL-6 的释放；刺激自噬或细胞凋亡，进而导致ALI 向 ARDS 进展。

调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）是一类控制体内自身免疫反应性的T 细胞亚群，它的抑制功能对于控制自身免疫、过敏和炎症反应及至关重要，在ALI 的发展过程中起到保护性作用[3−4]。IL-4 是Th2 细胞分泌的细胞因子，其对于Treg 介导的免疫抑制可能具有多种正向调节作用[5]。但对于在ALI 中IL-4 是否能够改善患者预后，目前鲜有报道。本研究将从体外细胞水平研究在ALI 中IL-4 对细胞凋亡及细胞因子分泌的作用，为临床ALI 诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究材料

人肺上皮细胞A549 细胞购自美国ATCC 细胞库，SYBR Green qPCR Mix 2.0 试剂盒购自广州Genecopoeia 公司，Caspase-3 抗体购自Abcam，Bcl-2 抗体购自GeneTex，IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-γ 的 ELISA 试剂盒均购自NeoBioscience，IL-4 细胞因子购自PeproTech。

1.2 研究方法

1.2.1 LPS 最佳干预条件测定使用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养A549 细胞72 h 后，将A549 细胞分为13 组，向培养基中加入LPS，使得培养基中LPS 浓度分别为10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL、50 µg/mL，每个浓度对应3 组A549 细胞，将上述各浓度中的3 组细胞分别在含LPS 的培养基中培养12 h、24 h、48 h，以未加入LPS的A549 细胞培养48 h 为空白对照。培养结束后，使用流式细胞术检测细胞凋亡率，确定LPS 的最佳干预浓度及时间。

1.2.2 IL-4 对ALI 细胞凋亡的影响选用上述最佳LPS 干预浓度及时间诱导A549 细胞凋亡，并将A549 细胞分为浓度控制组及时间控制组，每组各3 个亚组：浓度控制组的3 个亚组在加入LPS 的同时，分别加入0.1 µg/mL、1 µg/mL、10 µg/mL 的IL-4，与同时LPS 同时干预12 h；时间控制组的3 个亚组分别在加入LPS 前12 h、加入LPS 后6 h、加入LPS 后9 h 加入1 µg/mL 的IL-4，即IL-4 分别干预24 h、6 h、3 h；以只使用LPS 干预的A549 为对照组，不使用LPS 及IL-4干预的A549 为空白组。干预完成后，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，实时荧光定量PCR（qPCR）检测Caspase3、Bcl-2 的mRNA 的表达，蛋白质印迹法（Western blotting）检测Caspase3、Bcl-2 的蛋白表达情况。

1.2.3 IL-4 对ALI 中各细胞因子的影响使用上一部分确定的最佳IL-4 干预浓度及时间，使用LPS 及IL-4 同时干预实验组A549 细胞，对照组A549 细胞仅使用LPS 干预，空白组A549 细胞则不进行干预。干预结束后，离心取细胞培养上清液，酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法测定各组细胞上清液中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、TNFγ 分泌情况。

1.3 统计学处理

使用SPSS 21.0 对数据进行分析，2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差分析后使用Sidak 法进行多重比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 最佳干预条件

通过不同浓度LPS 对A549 细胞培养进行不同时长的干预，根据A549 细胞凋亡情况，LPS浓度10 µg/mL 干预时间12 h 时，A549 细胞凋亡率最高，见图1。认为此条件为LPS 诱导A549 细胞体外ALI 的最佳干预条件。

图1 LPS 最佳干预条件Fig.1 Optimal LPS intervention concentration

2.2 IL-4 对ALI 细胞凋亡影响的结果

使用上述LPS 浓度诱导A549 细胞形成ALI，作为对照组。与空白组（正常A549 细胞）相比，对照组的细胞凋亡率显著升高（1.86% vs 10.37%），差异有统计学意义（P<0.05）。IL-4 干预组细胞凋亡率显著低于对照组（P<0.001）。当干预时间相同，均为12 h 时，细胞凋亡率随IL-4 干预浓度的增加而降低（6.82% vs 3.38% vs 0.60%），差异有统计学意义（P<0.05）；当IL-4 浓度均为1 µg/mL 时，干预3 h 及6 h 细胞凋亡率无明显变化（5.01% vs 4.95%），差异无统计学意义（P>0.05）；而干预12 h 及24 h 以后，细胞凋亡率逐渐降低（3.38%，P=0.001；2.07%，P<0.001），差异有统计学意义（P<0.05），见图2、图3。

图2 各组细胞凋亡情况Fig.2 Apoptosis in each group

图3 流式细胞术检测细胞凋亡结果Fig.3 The results of apoptosis detected by flow cytometry

以β-actin 为内参，各组Caspase-3 与Bcl-2 蛋白表达水平，见图4。与空白组相比，对照组中Caspase-3 蛋白表达水平显著升高（1.75 vs 2.00，P=0.017），Bcl-2 蛋白表达水平显著降低（1.27 vs 0.31，P<0.001）。与对照组相比，IL-4 干预的各实验组Caspase-3 蛋白表达水平均下降（P=0.0122），干预时间均为12 h 时，Caspase-3 蛋白表达水平随IL-4 浓度增加而下降（1.56 vs 0.87 vs 0.31）；当IL-4 浓度均为1 µg/mL 时，干预6 h 及12 h 时Caspase-3 蛋白表达水平降至最低（0.86 vs 0.87，P>0.05），干预24 h 后表达水平回升（0.87 vs 1.17，P>0.05）。IL-4 干预各组的Bcl-2蛋白表达水平均高于对照组（P<0.001），干预时间均为12 h 时，IL-4 浓度为1 µg/mL 时，Bcl-2蛋白表达水平显著高于0.1 µg/mL（0.51 vs 1.36，P<0.001），但IL-4 浓度升高到10 µg/mL 以后，Bcl-2 蛋白表达也未明显升高（1.36 vs 1.41，P>0.05）；干预浓度均为1 µg/mL 时，IL-4 干预12 h后的Bcl-2 蛋白表达水平明显上升（0.54 vs 1.36，P<0.001），但继续干预至24 h 后，Bcl-2 蛋白表达水平也未继续升高（1.36 vs 1.27，P>0.05）。qPCR 验证Caspase3、Bcl-2 mRNA 表达情况的结果与其蛋白表达结果一致，以GAPDH 为内参，各组Caspase-3 与Bcl-2 mRNA 表达水平，见图5。

图4 各组Caspase3、Bcl-2 蛋白表达情况Fig.4 Expression of Caspase3 and Bcl-2 proteins in each group

图5 各组Caspase3、Bcl-2 mRNA 表达情况Fig.5 mRNA expression of Caspase3 and Bcl-2 in each group

2.3 IL-4 对ALI 中各细胞因子影响的结果

虽然IL-4 降低ALI 细胞细胞凋亡、抑制Caspase3 表达的效果随浓度和作用时间逐渐加强，但其促进Bcl-2 表达的效果在IL-4 浓度为1 µg/mL，作用12 h 时达到高点，因此后续研究均在此条件下进行。与空白组（正常A549 细胞）相比，对照组（ALI）IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ分泌显著增多，IL-10 分泌降低（P<0.05）；经1 µg/mL。的IL-4 干预12 h 后，实验组IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌显著降低，低于对照组（P<0.05）；而实验组IL-10 分泌增加，高于对照组（P<0.05）。各组细胞因子分泌浓度见表1、图6。

图6 各组细胞因子分泌情况Fig.6 Secretion of cytokines in each group

表1 各组细胞因子分泌情况（pg/mL）Tab.1 Secretion of cytokines in each group（pg/mL）

3 讨论

ALI 是肺内外的各种病因导致的急性低氧性呼吸功能不全综合症，其发病机制复杂，治疗效果不佳，平均病死率高达50%以上[6]，研究认为炎症与抗炎反应的平衡被打破是导致肺部炎性损伤的主要原因之一[1]。当肺部受到肺内外的各种病因因素影响时，中性粒细胞通过肺泡巨噬细胞和其他肺细胞类型产生的趋化信号募集到肺泡腔内部，释放蛋白酶、氧自由基、花生四烯酸代谢产物等损伤肺泡毛细血管内膜[7−8]。急性肺损伤的进展过程中炎症和抗炎反应持续发生，促炎症细胞因子，例如 IL-1、IL -6、TNF-α、TNF-γ等是引发肺部炎症反应的主要介质。其他炎症分子如趋化因子，巨噬细胞和中性粒细胞等则促进肺部炎症的进展[9]。

Tregs 是存在于正常人体内的一种具有负向调节免疫功能特征T 细胞亚群，其在维持免疫稳态中具有重要意义[10]。当Treg 细胞受到抗原特异性刺激活化时，能够通过分泌抑制性细胞因子IL-10，转化生长因子β1（TGF-β1）等细胞因子介导免疫抑制，防止机体发生过度的免疫反应[11]。Garibaldi[3]等的研究证实，Treg 能够通过抑制LPS 损伤后肺纤维细胞募集，从而减轻急性肺损伤过程中的肺纤维化。而在ALI 炎症修复期，肺泡内 Treg 细胞数量明显增多。临床观察也证实了肺泡 Treg 细胞较多的ALI 患者死亡率降低[4]。因此，Treg 可能能够减轻ALI 患者的炎症反应，加强 ALI 修复期的修复作用。

抗炎细胞因子IL-4 主要由CD4+T 细胞产生的，具有多种生物学活性，对B 细胞、T 细胞、肥大细胞和单核巨噬细胞都具有免疫调节作用[12]。研究表明，在IL-4 敲除的小鼠 ALI 模型中，其发病进展及炎症反应远高于ALI 正常小鼠模型，这表明IL-4 在ALI 过程中扮演重要角色[13−14]。Wehrmann F[15]等研究发现，γδ T 细胞可防止LPS 诱导的肺损伤，但抗 IL-4 阻断抗体可以逆转这种保护作用。但目前对IL-4 在ALI 中的作用机制尚无定论。本研究结果显示，与ALI 模型组相比，IL-4 干预的各组ALI 细胞的凋亡率显著降低，说明IL-4 对ALI 具有保护作用。除此之外，笔者还发现IL-4 浓度及其作用时间呈正相关。在本研究中，笔者也观察到IL-4 处理后Caspase-3 表达下调及Bcl-2 表达上调。Caspase-3 是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其可以促进细胞凋亡，而Caspase-3 的作用可以被Bcl-2 阻断；Bcl-2 可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡，其过度表达能增强细胞对多数细胞毒素的抵抗性。因此，笔者认为IL-4 在ALI 的发生发展中是保护性因素，其可以通过上调Bcl-2 表达，从而降低肺上皮细胞的凋亡，并改善其预后。

本研究检测了经IL-4 处理后相关炎性细胞因子的变化情况，结果显示，ALI 时促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌显著升高，而抗炎细胞因子IL-10 在ALI 组分泌显著降低，该结论与以往ALI 相关研究一致。而通过IL-4 干预后，实验组的IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌显著降低，其中TNF-α、TNF-γ 甚至可低于正常A549 细胞，且IL-10 分泌增加。Wehrmann F等[15]认为γδT 细胞可能通过调节肺中的TNFα 水平来限制巨噬细胞的扩增，进而抑制肺损伤。而Farivar 等[16]研究发现，在缺血再灌注肺损伤模型中，IL-4 与IL-10 可以协同降低IL-1β 和TNF-α 的水平，以达到减轻肺损伤的作用。有学者认为[17]，受损肺泡中的活化巨噬细胞、中性粒细胞和潜在的上皮细胞可以产生IL-6，后者可通过介导炎症反应导致肺损伤。上述结论均支持本研究的结果，因此笔者推断，IL-4 可能通过多种途径抑制ALI 发生发展过程中的过度免疫反应，从而发挥其保护性作用。Pace L 等[18]的研究发现，IL-4 可促进Treg 细胞增殖，且Treg 细胞的免疫抑制能力增强。笔者推断其可能的机制：IL-4 可阻止叉头翼螺旋转录因子3（Forkhead Box P3，Foxp3）表达下调，而Foxp3 是Treg 细胞的特异标志物，并对其增殖和功能发挥起决定性作用。因而通过维持Foxp3 的表达，增强了Treg 细胞免疫调节功能[19−20]。

在ALI 的发生发展中，炎症及抗炎反应占据核心地位，涉及多种复杂调节机制。本研究阐明急性肺损伤中IL-4 可能刺激相关炎性因子发挥正向调节作用，从而缓解急性肺损伤。但本研究目前仅限于体外实验，其具体机制尚未完全阐明，仍需要后续动物实验及基因、信号通路层面的研究验证笔者的猜想。以期通过分子学的角度进行干预治疗，提高急性肺损伤的治愈率。