FAM20C在小鼠下颌髁突发育过程中的时空表达

祁 皓，马 肃,2，袁朝阳，吴国栋，刘培红,2

下颌髁突软骨(mandibular condylar cartilage，MCC)是覆盖下颌髁突表面的次级软骨，由软骨细胞和细胞外基质组成[1]。MCC作为下颌骨的发育中心，对下颌骨的形态发生和长度、高度的增长至关重要[2]。研究表明，多种生长因子和信号通路参与髁突发育，包括成纤维细胞生长因子23，Wnt信号通路及FAM20(family with sequence similarity 20)家族成员蛋白等[3-5]。

FAM20C是FAM20家族三个成员之一，又被称为牙本质基质蛋白4，是一种高尔基酪蛋白激酶，在多种生理和病理过程中发挥重要作用[6]。FAM20C通过磷酸化S-x-E/pS序列中的丝氨酸残基，修饰细胞外基质蛋白，参与组织矿化、脂质稳态、伤口愈合、细胞分化等多种生物过程[7]。敲除Fam20C基因的小鼠发生严重的低磷性佝偻病，表现为血清和骨中磷酸盐降低和成纤维细胞生长因子23升高[8]。人类Fam20C突变导致Raine综合征，表现为骨硬化性骨发育不良、佝偻病、软骨病以及低磷血症等[9]。

目前FAM20C在骨、牙齿发育及矿化方面的研究已有一些进展[10-11]，而关于FAM20C在下颌髁突中的表达和作用机制尚无报道。本研究通过免疫组化观察小鼠出生前后下颌髁突软骨中FAM20C的表达情况，推测其在下颌髁突发育中的潜在作用，为进一步的机制研究奠定组织学基础。

1 材料与方法

1.1 动物和组织准备

选取20只8周龄野生型C57BL/6小鼠(体质量18～24 g)作为亲代小鼠。实验设计经哈尔滨医科大学动物伦理委员会批准。小鼠合笼交配，晨起观察到阴道栓确定妊娠，记为胚胎0.5 d(E0.5)。取胚胎17.5 d(E17.5)和出生后0、7、21 d(P0、P7、P21)共4个时间点小鼠的下颌髁突，4%多聚甲醛常规外固定。其中P7和P21组小鼠下颌髁突分别在15%EDTA(pH=7.4)溶液中4 ℃低温脱钙3 d和9 d。各组标本以矢状位常规制作蜡块，每组选取5个小鼠髁突组织蜡块进行4 μm厚连续切片，4 ℃保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

苏木素染液、伊红染液(北京兰杰柯)；改良番红O-固绿染色液试剂盒(北京索莱宝)；PV-两步法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德)；兔抗FAM20C多克隆抗体(哈尔滨医科大学附属第一医院龙江学者实验室)；HRP标记的羊抗兔二抗(武汉博士德)。Leica DM2500光学显微镜(德国徕卡)，Nikon ECLIPSE 80i显微镜、NIS-ELements BR 3.0成像分析系统(日本尼康)。

1.3 组织切片染色

1.3.1 苏木精-伊红(HE)染色 按照常规染色步骤进行。

1.3.2 改良番红O-固绿染色 严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 免疫组化染色 每组选取5只小鼠髁突组织蜡块，取连续切片中间部位一张进行FAM20C免疫组化染色。柠檬酸修复液(pH=6.0)高温抗原修复；3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶；山羊血清封闭；一抗(FAM20C，1∶100稀释)，IgG代替一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜；二抗37 ℃孵育30 min；DAB显色；甲基绿复染。

1.3.4 结果判读 改良番红O-固绿染色结果判读：软骨基质为深红色，软骨细胞核为蓝色，细胞质、肌肉、胶原纤维及骨组织为灰绿色；免疫组化染色结果判读：棕黄色颗粒为蛋白阳性表达。

1.4 免疫组化结果的半定量分析

每组选取5只小鼠免疫组化切片进行半定量分析，将每张切片中的髁突分为前、中、后3个部位，在高倍镜下每个部位随机选取1个视野拍照。通过Image-pro plus 6.0图像软件测量每张切片3个部位FAM20C阳性区域的累计光密度值(integrated optical density，IOD)，以阳性区域IOD与图片面积的比值——平均光密度值(mean optical density，MOD)作为免疫组化半定量指标，每张切片3个部位MOD取平均值，即为该切片FAM20C的阳性表达强度。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 组织学结果

鉴于E17.5、P0和P7髁突在100倍镜下基本可以展示全貌，所以选取100倍镜下拍照，但是P21髁突体积较大，只选取中间部位拍照。E17.5小鼠髁突染色结果可见髁突软骨明显，番红O染色可见基质充满细胞间隙，软骨细胞排列整齐。P0小鼠髁突染色结果可见髁突软骨的长度和宽度明显增加，尤其是肥大细胞区，各层软骨细胞清晰可辨，包括关节表面纤维层、静止软骨细胞层、增殖软骨细胞层、前肥大软骨细胞层、肥大软骨细胞层(非矿化)和矿化肥大软骨细胞层。P7小鼠髁突染色结果可见髁突前、中、后带轮廓初具，髁突软骨初级结构基本形成。P21小鼠髁突染色结果可见髁突前、中、后带形态分明，发育接近完成。P0、P7、P21，随着软骨内骨化的进展，肥大软骨细胞层纵向缩短，软骨下骨体积增加，下颌髁突体积增大。见图1～3。

Td：颞下颌关节盘；S：关节表面纤维层；R：静止软骨细胞层；P：增殖软骨细胞层；Pr：前肥大软骨细胞层；H：肥大软骨细胞层(非矿化肥大软骨细胞区)；M：矿化肥大软骨细胞层；Sub：软骨下骨

2.2 免疫组化染色结果

4组小鼠髁突软骨组织中均有FAM20C表达，随着髁突软骨发育，FAM20C表达逐渐减少。在增殖软骨细胞层中，FAM20C主要位于细胞核；在前肥大软骨细胞层和肥大软骨细胞层中，FAM20C主要位于细胞质。E17.5组，在增殖软骨细胞层、整个肥大软骨细胞层及软骨下骨中均可以看到FAM20C强阳性染色且分布广泛。P0组，在增殖软骨细胞层和前肥大软骨细胞层中FAM20C阳性染色较明显，肥大软骨细胞层中染色相对较弱且散在分布。P7组，FAM20C阳性染色主要集中在增殖软骨细胞层和软骨下骨中，肥大软骨细胞层中阳性染色零星分布。P21组，阳性染色明显减少，主要沿增殖软骨细胞层分布，肥大软骨细胞层及软骨下骨中极少量表达。见图4。

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

2.3 FAM20C表达的半定量分析

E17.5、P0、P7和P21组中FAM20C的MOD值分别为0.583±0.015、0.479±0.023、0.353±0.014和0.281±0.013，组间比较F=306.296，P<0.05，4组MOD差异具有统计学意义(P<0.05)，两两组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

FAM20家族由 FAM20A、FAM20B和FAM20C三个成员组成[12]。条件性敲除小鼠Fam20B，小鼠髁突软骨细胞增殖能力减弱，软骨分化过程受到抑制，髁突形态纤薄短小，证明Fam20B对于髁突软骨发育至关重要[5]。研究表明FAM20C可以磷酸化修饰大多数分泌蛋白。其中小整合素结合配体-N-连接糖蛋白家族(small integrin binding ligand-N-linked glycoproteins，SIBLINGs)在髁突软骨发育过程中发挥重要作用，而该家族成员蛋白已被证明是FAM20C的直接底物[6,13]。此外，在长骨成骨过程中，长骨软骨细胞和成骨细胞中可以检测到FAM20C mRNA，在成熟软骨细胞、关节软骨细胞和增生性软骨细胞中可以检测到FAM20C蛋白，表明FAM20C可能参与长骨软骨的形成[14]。基于上述研究结果，我们猜测FAM20C可能参与髁突软骨发育。

本实验在使用传统HE染色进行组织学观察的基础上，结合改良番红O-固绿染色方法观察了下颌髁突软骨及软骨下骨的形态学变化。因为软骨基质含有特定的蛋白多糖，这些蛋白多糖包含许多阴离子糖链，可以结合番红O、固绿进行染色。软骨与番红O结合呈现红色，骨与固绿结合呈现绿色或蓝色，与呈现红色的软骨对比鲜明，从而将软骨组织和骨组织区域明显分开[15]。本实验改良番红O-固绿染色结果表明：随着软骨内骨化的进展，软骨细胞层纵向缩短，软骨下骨体积增加，这与既往研究结论一致[5]。

在哺乳动物中，骨形成的方式有两种：膜内成骨和软骨内成骨。传统观点认为MCC的成骨方式为软骨内成骨，即软骨祖细胞首先通过增殖和分化成软骨细胞形成软骨，后软骨细胞肥大、凋亡，引发血管侵入，最终被骨取代[16]。近期有研究表明，少量软骨细胞可以在下颌髁突组织中直接分化为成骨细胞，参与下颌髁突软骨下骨的形成[17]。在软骨内成骨过程中，软骨细胞经历严格控制的增殖和分化阶段，调节软骨内骨的纵向生长[18]。本实验研究结果显示：在4个时间点，增殖软骨细胞层中均有FAM20C阳性表达，且随着时间的推移，阳性表达逐渐减少。在胚胎期及出生后早期阶段的肥大软骨细胞中FAM20C高表达，而在髁突软骨发育后期FAM20C表达较弱，这表明FAM20C可能参与了髁突软骨早期软骨细胞的分化。

本实验结果提示FAM20C在小鼠下颌髁突发育中具有一定的生物学作用，可能通过调节软骨细胞增殖和软骨细胞分化速率来塑造或维持下颌髁突软骨的形态，参与下颌髁突成骨过程，关于FAM20C调控下颌髁突发育的具体机制尚需进一步体内外研究。