降解温和气单胞菌AHLs乳酸菌的筛选及在三文鱼保鲜中的应用

高永悦，吕欣然,*，杜 宏，崔晓玲，俞美辰，白凤翎，励建荣,2，王明丽，周小敏，郭晓华

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州 121013；2.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034；3.蓬莱京鲁渔业有限公司，山东 烟台 265600；4.浙江兴业集团有限公司，浙江 舟山 316100；5.山东美佳集团有限公司，山东 日照 276800）

温和气单胞菌（）是水产品中常见的优势腐败菌，可通过产生-酰基高丝氨酸内酯（-acyl-homoserine lactones，AHLs）类信号分子响应群体感应通讯通路，进而启动毒力因子或生物膜等相关基因的表达，从而导致水产品腐败，引起严重的水产品安全问题。在温和气单胞菌的LuxI/R群体感应系统中，AHLs类信号分子与受体蛋白结合，激活转录调控因子LuxR，从而调控生物膜、胞外蛋白酶、嗜铁素等致腐基因表达。Li Tingting等研究证实添加外源信号分子可提高温和气单胞菌的致腐能力，提高冷藏大菱鲆鱼片细菌菌落总数和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值，从而加速产品的腐败。抗生素是控制微生物繁殖的主要手段，然而其在水产品中易积累富集，抑制机体免疫反应，并导致抗生素耐药细菌的出现，严重危害人类健康和生态环境系统。因此，抗生素在水产养殖中的使用受到限制。针对该问题，群体感应淬灭被认为是控制水产品腐败菌的新途径，因其不以微生物细胞为作用靶点，不会使细菌产生耐药，逐渐成为防腐领域研究的热点。

群体感应淬灭剂主要可通过抑制AHLs合成、竞争性抑制AHLs与受体蛋白结合、AHLs降解等淬灭方式干扰细菌群体感应系统。AHLs降解主要是依靠微生物分泌的AHLs内酯酶、酰基转移酶、氧化还原酶等酶的分解作用。目前，国内外研究报道中可分泌AHLs降解酶的微生物主要包括芽孢杆菌属、乳杆菌属、不动杆菌属等，但关于乳酸菌来源的AHLs降解酶鲜有报道。乳酸菌是一种安全高效的抗菌剂，其自身或代谢产物可通过抑制AHLs合成、竞争性抑制AHLs与受体蛋白结合、AHLs降解等淬灭方式干扰细菌群体感应系统。本课题组Cui Tianqi等研究了面包乳杆菌ZHG 2-1淬灭酶粗提物对铜绿假单胞菌AHLs降解活性，实时聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）结果表明群体感应相关基因/和/的表达下调。

本研究以产AHLs类信号分子的温和气单胞菌AS7为目标菌，从传统发酵食品分离的乳酸菌中筛选对温和气单胞菌信号分子具有降解活性的菌株，对其淬灭酶存在位置、种类及最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）进行分析。同时，以三文鱼为载体，通过测定细菌菌落总数、持水力、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值以及TVB-N值等指标评价乳酸菌控制温和气单胞菌致腐能力的效果，旨在为控制AHLs介导的革兰氏阴性细菌群体感应系统导致的水产品腐败问题提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三文鱼购买自锦州海芝鲜挪威三文鱼店。

乳酸菌菌株：分离自面团、酸汤面、酸菜、酸豆角等传统发酵食品中；目标菌株：温和气单胞菌AS7，分离自腐败大菱鲆体表；报告菌株：紫色色杆菌（）CV026为ATCC31532的mini-Tn5突变体，该菌株自身不产生AHLs信号分子，当添加-丁酰基--高丝氨内酯（-butanoyl--homoserine lactone，C-HSL）、辛酰基--高丝氨酸内酯（octanoyl--homoserine lactone，C-HSL）等外源短链AHLs时即可产生紫色菌素。以上菌株由本实验室保藏。

MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培养基、LB（Luria-Bertani）培养基、平板计数培养基 北京奥博星生物技术有限公司；乳酸菌生化鉴定管 杭州天和微生物试剂有限公司；Tris-HCl、卡那霉素、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、DNA marker-D、PCR Master mix生工生物工程（上海）股份有限公司；TBA 上海源叶生物科技有限公司；三氯乙酸 天津市汇杭化工科技有限公司；氧化镁 宜城晶瑞新材料有限公司。

1.2 仪器与设备

DL-CJ-2N超级洁净工作台 北京市东联哈尔仪器制造有限公司；SPX-25生化培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂；5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；GI54DS立式高压蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DYY-8C电泳仪 北京市六一仪器厂；Quantity One凝胶成像系统、Imark酶标仪 美国Bio-Rad公司；ABI stepone plus PCR仪 德国Eppendorf公司；Free Zone 2.5台式真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；JYSA800型绞肉机 九阳股份有限公司；UV2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Y25小型均质乳化机 上海约迪机械设备有限公司；Bagmixer400拍击式均质器 法国Interscience公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；KDY9820自动凯氏定氮仪 北京瑞邦兴业科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 温和气单胞菌AHLs粗提物的制备

将温和气单胞菌3 代培养物于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，并用0.22 μm滤膜真空抽滤，收集温和气单胞菌无细胞上清液（cell-free supernatant，CFS）。将100 mL温和气单胞菌CFS分装至分液漏斗中，与20 mL含有0.01%冰醋酸的乙酸乙酯溶液振荡混匀，静置萃取5 min，收集乳化层于圆底蒸发瓶中，重复上述步骤5 次合并萃取液。利用真空旋转蒸发仪将萃取液于50 ℃、120 r/min处理至乙酸乙酯完全蒸发，体积分数70%甲醇溶液溶解干燥物，保存至1.5 mL无菌离心管中，置于－20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 降解温和气单胞菌AHLs粗提物乳酸菌筛选

96 孔板法初筛：将1.0 mL乳酸菌二代培养物调节至pH 7.0，加入10 μL AHLs粗提物混合均匀，30 ℃静置培养24 h。将共培养物pH值调至7.0，于4 ℃、10 000 r/min离心5 min获得上清液，备用。在96 孔板中加入100 μL素琼脂，待其凝固后将10 μL上清液点样于素琼脂表面，最后用100 μL含有CV026（体积比1∶5）的LB琼脂封顶，30 ℃静置培养24 h。以无菌MRS液体培养基与等量的温和气单胞菌AHLs共培养物作阴性对照。

牛津杯打孔法复筛：按上述方法获得共培养物上清液。首先将10 mL素琼脂平铺至平板底部，待其凝固后放入牛津杯，将含有2.0 mL CV026的LB琼脂倒入平板，冷却凝固后将牛津杯取出，孔内加入180 μL共培养物，30 ℃静置培养24 h后，利用全自动菌落计数仪测量孔周围的紫色晕圈直径。以无菌MRS液体培养基与等量的温和气单胞菌AHLs共培养物作阴性对照。按式（1）计算乳酸菌对温和气单胞菌AHLs降解率：

式中：为对照组紫色圈直径/mm；为乳酸菌处理组紫色圈直径/mm。

1.3.3 乳酸菌群体淬灭酶及活性位置的确定

乳酸菌CFS的制备：过夜培养的乳酸菌4 ℃、10 000 r/min离心5 min，上清液使用0.22 μm无菌滤器过滤，滤液于4 ℃冰箱备用。

乳酸菌胞内粗提物（crude cell extract，CCE）的制备：使用pH 6.5的磷酸盐缓冲液洗涤乳酸菌沉淀物2 次，将其重悬于5.0 mL相同缓冲液中，在低温条件下超声破碎菌体5 min后，4 ℃、10 000 r/min离心30 min，上清液用0.22 μm无菌过滤器过滤，获得乳酸菌CCE，4 ℃冰箱备用。

将10.0 μL温和气单胞菌AHLs粗提物分别与上述1.0 mL CFS、1.0 mL热灭活CFS、1.0 mL CCE于30 ℃共培养24 h，应用牛津杯打孔法测定乳酸菌CFS和CCE对温和气单胞菌AHLs的降解活性。

1.3.4 乳酸菌群体淬灭酶对AHLS的降解作用

温和气单胞菌AS7 AHL类信号分子主要有C-HSL、C-HSL和C-HSL。采用体积分数70%甲醇溶液将C-HSL、C-HSL 和C-HSL信号分子标准品配制成200 μg/L的溶液，备用。将乳酸菌CFS和信号分子标准品按1.3.3节共培养步骤过夜培养，应用牛津杯打孔法测定乳酸菌粗提物对AHL的降解作用。

1.3.5 乳酸菌群体淬灭酶类型的鉴定

乳酸菌粗提物的制备同1.3.1节，萃取剂为不含冰醋酸的乙酸乙酯。参考李婷婷等方法稍作修改。将乳酸菌粗提物用1.0 mol/L HCl溶液调至pH 2.0，30 ℃静置培养24 h，应用牛津杯打孔法检测pH 7.0和pH 2.0上清液的降解效果。

1.3.6 乳酸菌粗提物MIC测定

将活化3 代的温和气单胞菌菌悬液稀释至10CFU/mL，以2%接种量于5 mL LB培养基中，加入不同浓度的乳酸菌粗提物200 μL至其终质量浓度为0、2.0、4.0、6.0、8.0、16.0、32.0 mg/mL，以添加等量MRS肉汤作为空白对照，30 ℃静置培养24 h后，肉眼观察到无浑浊现象试管对应浓度为MIC。

取180 μL菌悬稀释液于96 孔板中，再分别加入20 μL不同亚抑制浓度（0.25 MIC、0.50 MIC和0.75 MIC）乳酸菌粗提物，加入等量MRS肉汤作为阴性对照，30 ℃静置培养，每隔2 h测定OD，连续检测24 h，验证亚抑制浓度乳酸菌粗提物对温和气单胞菌生长的影响。

1.3.7 乳酸菌菌株鉴定

参照文献[16]，对具有降解温和气单胞菌AHLs作用的乳酸菌菌株进行生理生化鉴定。参照林洋等方法进行16S rDNA序列分析。

1.3.8 乳酸菌粗提物对三文鱼的保鲜作用

1.3.8.1 无菌鱼块的制备

参照Herbert等方法并稍作修改。在无菌操作台内制备无菌鱼肉样品，利用75%乙醇溶液擦拭鱼体，去除鱼皮后，用无菌菜刀将鱼肉切成约10 g/块的鱼块备用。将制备好的鱼块采用浸泡法处理，具体处理方式如表1所示，筛选乳酸菌粗提物质量浓度为6 mg/mL，温和气单胞菌菌液浓度为10CFU/mL。将无菌鱼块在不同处理方式下浸泡30 min后捞出沥干，装入无菌蒸煮袋中于4 ℃密封保存。2 d/次进行取样，对不同处理组中细菌菌落总数、持水力、TBA值以及TVB-N值进行测定。

表1 无菌三文鱼的不同处理方式Table 1 Different processing methods for sterile salmon

1.3.8.2 细菌菌落总数测定

参照GB 4789.2ü2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》，取不同处理的三文鱼样品于蒸煮袋中，分别加入无菌生理盐水90 mL，用拍击式均质器拍打2 min，采用10 倍稀释法对样品进行稀释，选择3 个适宜浓度，30 ℃培养24 h，记录菌落总数。

1.3.8.3 持水力测定

参照Castellini等的方法并稍作修改。取三文鱼样品精确称量其质量，记为。用滤纸包住鱼块并置于离心管中，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，离心后的鱼肉质量记为，按式（2）计算鱼肉的持水力：

1.3.8.4 TBA值的测定

参照GB 5009.181ü2016《食品中丙二醛的测定》。精确称取三文鱼样品5.0 g，准确加入50 mL三氯乙酸（7.5%）混合液，均质过滤。取5 mL滤液与TBA溶液（0.02 mol/L）混合后，90 ℃水浴30 min，冷却后测量其OD。

1.3.8.5 TVB-N值的测定

参照Li Tingting等的方法并稍作修改。利用绞肉机将三文鱼样品绞碎，分装至750 mL蒸馏管中，添加1.00 g轻质氧化镁，与半自动凯氏定氮仪相连接。利用10 mL 2%硼酸溶液收集馏出液，并用0.01 mol/L标准盐酸溶液滴定。记录盐酸所消耗的体积，TVB-N值以mg/100 g表示。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 降解温和气单胞菌AHLs粗提物乳酸菌的筛选

从90 株乳酸菌中初筛到12 株乳酸菌，可以使CV026不产生紫色或产生的量远小于对照组（图1a），初步判断这些菌株对AHLs具有降解活性。通过复筛实验，12 株乳酸菌对温和气单胞菌AHLs降解能力显著，降解率在26.51%～100%之间。图1b为乳酸菌LNL2-1、ZSC1-3、YF-8对温和气单胞菌的降解效果。其中来源于辽宁朝阳泡菜的菌株YF-8使紫色杆菌几乎无紫色晕圈产生，表明降解活性较好，降解率接近100%，因此，后续实验选择菌株YF-8进行下一步研究。

图1 乳酸菌降解温和气单胞菌AHLs的筛选结果Fig.1 Results of screening of lactic acid bacteria degrading AHLs from A.sobria

2.2 YF-8群体感应淬灭酶位置、类型及对AHLs信号分子降解作用的分析

由图2a可知，菌株YF-8 CCE孔周围的紫色圈与阴性对照组相比无显著差异，表明其CCE不具有降解活性。但菌株YF-8 CFS孔周围的紫色圈远小于对照组，表明淬灭酶主要存在于菌株CFS中。由图2b所示，菌株YF-8 CFS经热灭活处理后，与对照组紫色圈无显著差异，由此可确证YF-8粗提物淬灭物质为蛋白酶类。菌株YF-8 CFS对信号分子标准品的降解图显示孔周围有淡紫色晕圈，表明其对C-HSL、C-HSL和C-HSL的降解效果较好。

AHLs-内酯酶是一类可将信号分子内酯环结构破坏的酶，但在酸性条件下信号分子的内酯环会重新环化。图2c中，当YF-8粗提物与AHLs共同存在时，pH 2.0和pH 7.0的共培养物上清液孔周围均不产生紫色圈，表明上清液中信号分子被降解，在酸性条件下有效酶的活性依然存在，因此产生降解活性的物质不是AHLs-内酯酶，可能是AHLs-酰基转移酶。

图2 YF-8的群体感应淬灭酶位置及类型分析Fig.2 Identification of the location and type of quorum quenching enzyme from YF-8

2.3 MIC分析

由图3A所示，YF-8淬灭酶粗提物对温和气单胞菌的MIC为8.0 mg/mL。由图3B可知，与对照组相比，当YF-8淬灭酶粗提物在亚抑制质量浓度6.0 mg/mL时，温和气单胞菌的生长速度与对照相比略有差异，但不足以杀死细菌。因此，选择YF-8淬灭酶粗提物质量浓度为6.0 mg/mL进行后续研究。

图3 不同质量浓度YF-8淬灭酶粗提物对温和气单胞菌生长的影响Fig.3 Effect of different concentrations of YF-8 crude extract on the growth of A.sobria

2.4 乳酸菌菌株鉴定

表2表示菌株YF-8的生理生化鉴定结果，可初步判断菌株YF-8为戊糖片球菌（）。将YF-8的PCR产物进行凝胶电泳检测，结果发现在1 500 bp左右出现特异性亮带，表明目标片段被成功扩增（图4a）。通过与NCBI数据库获得的序列比较并构建系统发育树结果可知（图4b），菌株YF-8与MT510516.1的16S rDNA最为相似，支持率为100%，因此可确证菌株YF-8为戊糖片球菌。

表2 菌株YF-8的生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical test results of strain YF-8

图4 菌株YF-8的16S rDNA基因扩增电泳图（a）及16S rDNA系统发育树（b）Fig.4 PCR amplification of 16S rDNA gene (a) and phylogenetic tree for 16S rDNA sequence (b) of strain YF-8

2.5 YF-8淬灭酶粗提物对三文鱼的保鲜作用

2.5.1 细菌菌落总数分析

国际食品微生物委员会规定生食鱼片的菌落总数最低接受水平为5h10CFU/g，安全限值为10CFU/g。图5a表示不同处理组的三文鱼在4 ℃条件冷藏10 d细菌菌落总数变化情况，贮藏初始，对照组及不同处理组三文鱼样品的菌落总数均小于最低接受水平，表明鱼肉品质良好；贮藏第4天时，AS组的菌落总数超过5h10CFU/g；第6天时，NC组菌落总数为6.39（lg（CFU/g）），超过最低接受水平，小于安全限值；在贮藏第10天时，T组及T组细菌菌落总数分别为6.52（lg（CFU/g））和6.16（lg（CFU/g）），超过最低接受水平未超过安全限值，而两对照组均超过安全限值，与NC组和AS组相比，可延长货架期分别为2 d和4 d。

图5 YF-8淬灭酶粗提物对三文鱼的保鲜作用Fig.5 Effect of YF-8 crude extract on quality preservation of salmon

2.5.2 持水力分析

持水力反映鱼肉在受到外力作用时保持原有水分以及防止水分流失的能力。由图5b可见，冷藏初期，各组三文鱼的持水力在88%以上，T组及T组的持水力始终高于空白对照NC组和阴性对照AS组；贮藏末期第10天时，与AS对照相比，T组持水力提高了6.88%；与NC对照相比，T组持水力提高了5.91%。

2.5.3 TBA值分析

TBA值是用于评估脂质氧化程度的重要指标之一。三文鱼脂肪中不饱和脂肪酸含量高，容易发生脂质氧化产生丙二醛，产生难闻的气味，在一定条件与TBA缩合形成红色物质。当TBA值达到1.0～2.0 mg/kg时，会产生难以接受的气味。三文鱼在不同处理条件下TBA值的变化情况如图5c所示，贮藏第10天时，NC组和AS组的TBA值大于1.0 mg/kg，而T组及T组TBA值分别为0.85 mg/kg和0.73 mg/kg。

2.5.4 TVB-N值分析

TVB-N值是评定水产品新鲜程度的重要指标之一。三文鱼肉在酶和细菌的作用下，分解蛋白质产生具有挥发性的氨以及胺类等碱性含氮物质，其含量越高，表明氨基酸被破坏越多，从而影响鱼肉营养价值。由图5d可见，鱼肉的初始TVB-N值小于15 mg/100 g，随着冷藏时间的延长TVB-N值逐渐呈上升趋势，NC组和AS组的上升速度显著高于T组和T组；贮藏6 d，T组和T组TVB-N值为18.78、16.99 mg/100 g，鲜度下降；贮藏10 d，T组和T组TVB-N值显著低于NC组和AS组。

因此，YF-8淬灭酶粗提物可通过降解AHLs信号分子阻断群体感应通路，进而降低温和气单胞菌致三文鱼腐败的能力，分别表现为控制细菌菌落总数在安全限值内，减缓鱼肉持水力的降低，延缓三文鱼贮藏过程中TBA值及TVB-N值的上升。陈桂芳等报道了竞争型群体感应抑制剂肉桂油对感染荧光假单胞菌的大菱鲆鱼汁腐败作用的抑制效果，在4 ℃条件下贮藏12 d，肉桂油处理组细菌菌落总数和TVB-N值显著降低，因此肉桂油可通过干扰荧光假单胞菌的群体感应系统降低其腐败能力，与本研究结果类似。

3 结 论

从发酵食品中筛选出具有降解温和气单胞菌AHLs的戊糖片球菌YF-8，降解活性近100%。YF-8淬灭酶主要存在于CFS中，初步鉴定不是AHLs内酯酶，对AHLs信号分子标准品C-HSL、C-HSL和C-HSL的降解效果良好。YF-8淬灭酶粗提物对温和气单胞菌的MIC为8.0 mg/mL，2.0、4.0、6.0 mg/mL的YF-8淬灭酶粗提物不影响温和气单胞菌的生长。在体外三文鱼保鲜实验中，与对照组相比，YF-8处理组有效控制三文鱼块中细菌菌落的生长，减缓持水力的下降及TBA值和TVB-N值的上升，从而抑制温和气单胞菌的致腐能力，旨在为控制AHLs介导的革兰氏阴性菌群体感应致水产品腐败提供理论基础。