混菌发酵对贺兰山东麓‘赤霞珠’干红葡萄酒香气的影响

夏鸿川，张 众，孙丽君，李 伟，张军翔*

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021；3.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021；4.中国葡萄酒产业技术研究院，宁夏 银川 750021）

葡萄酒的乙醇发酵是由酿酒酵母主导、非酿酒酵母参与，将葡萄中的糖转化为二氧化碳和乙醇的生物化学过程，并伴随着甘油、高级醇、醛类、酯类等物质的合成代谢。由于商业酿酒酵母具有较好的发酵性能和胁迫耐受性，在实际生产过程中得到了广泛的应用。然而，商业酿酒酵母的广泛使用也是导致发酵微生物群落结构单一化的主要原因，因为接种商业酿酒酵母后会限制其他微生物的生长。虽然这种方法可促进葡萄酒品质的标准化，但从另一角度也导致了许多地区葡萄酒的同质化、香气及口味不够复杂、品质缺乏特色和典型性的问题。

近年研究发现，许多非酿酒酵母能够产生大量的甘油、酯类等代谢产物，也能够产生一些利于香气前体水解并释放出游离态香气成分的糖苷酶，对葡萄酒的风味形成具有重要作用。但也存在一些缺陷，例如大多数非酿酒酵母耐乙醇能力弱、发酵性能低以及高产乙酸等。因此，为了保证发酵完全且避免产生不良副产物，通常将这些非酿酒酵母与酿酒酵母进行混菌发酵，包括同时接种和顺序接种两种形式。前者是将非酿酒酵母与酿酒酵母按比例同时接种于葡萄醪中，后者是先接种高细胞浓度的非酿酒酵母，随后（如1～3 d后）再接种酿酒酵母进行后期的发酵。这两种方式都可以提高葡萄酒香气的复杂度，但具体的选择则需要根据酵母种类及酵母之间的互作模式确定。不同非酿酒酵母在混菌发酵中的作用大不相同，会给葡萄酒香气带来不同的特点。例如，葡萄汁有孢汉逊酵母（）可以分泌多种胞外酶（葡萄糖苷酶、木糖苷酶、蛋白酶），能在发酵初始阶段代谢出更复杂的挥发性香气物质。毕赤酵母能够高产乙酸乙酯、乙酸异丁酯和乙酸异戊酯等酯类物质，因此具有提升葡萄酒花香及果香的潜力，同时还可以提高挥发性硫醇含量，给葡萄酒带来黑醋栗、甘草、黑胡椒、薄荷的香气。Clemente-Jimenez等研究表明，使用发酵毕赤酵母（）与酿酒酵母顺序接种发酵‘马卡贝奥’白色葡萄品种，结果显示间隔2 d的顺序接种，不仅可以减少醋酸的产生，还可以增加葡萄酒中乙酸乙酯、1-丙醇、正丁醇、1-己醇、癸酸乙酯和甘油的含量。近年来，消费市场对不同类型和风格葡萄酒的需求不断增长，而混菌发酵作为一种调控葡萄酒香气特性的新工艺，成为了研究和应用的热点之一。

本研究以宁夏贺兰山东麓‘赤霞珠’葡萄为原料，利用3 种优选非酿酒酵母（葡萄汁有孢汉逊酵母、发酵毕赤酵母和毕赤克鲁维酵母（））与酿酒酵母分别进行不同方式的混菌发酵，探究混合发酵过程中酵母的生长状况，以及葡萄酒理化指标、香气成分、感官特征的差异性，旨在确定有利于‘赤霞珠’葡萄酒酿造的混菌发酵工艺，充分发掘宁夏贺兰山东麓‘赤霞珠’葡萄酒的风格与潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘赤霞珠’（L.cv.Cabernet Sauvignon）于2020年10月6日取自宁夏回族自治区青铜峡甘城子产区，还原糖254 g/L，可滴定酸（以酒石酸计）5.1 g/L，pH 3.78，卫生状况良好。

葡萄汁有孢汉逊酵母Yun268菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为M2013658；发酵毕赤酵母Z9Y-3和毕赤克鲁维酵母C735保藏于西北农林科技大学葡萄酒学院。以上3 种非酿酒酵母酵母均由西北农林科技大学葡萄酒学院提供，在使用前重新进行26S rRNA D1/D2区域序列鉴定，确认菌种后备用。酿酒酵母（Excellence XR）购于法国Lamothe Abiet公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基、沃勒斯坦实验室营养（Wallerstein laboratory nutrient，WLN）琼脂培养基青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；二甲基二碳酸盐 重庆长风生物科技有限公司；无水乙醇（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；C～C正构烷烃（≥99.7%，色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司；4-甲基-2-戊醇（≥98.0%，色谱纯） 日本TCI公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000D气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用仪、DB-WAX色谱柱（30 mh250 μm，0.25 μm） 美国Agilent公司；PAL3自动进样器 瑞士CTC公司；TU-1901型分光光度计北京普析通用仪器有限公司；Enology Y15葡萄酒全自动分析仪 西班牙Biosystems公司；雷磁PHS-3C pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；ME104E电子天平瑞士Mettle公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化培养与计数

将保藏的非酿酒酵母菌株解冻后，划线培养于YPD固体培养基上，28 ℃条件下培养24 h后重复活化1 次。在YPD固体培养基上挑取菌落特征明显的非酿酒酵母菌株接种于200 mL的YPD液体培养基中，于28 ℃、180 r/min条件下培养至对数生长期，低温（4 ℃）离心后收集菌体，并经无菌水洗涤后对酵母进行计数，最后按比例接入葡萄醪中。酿酒酵母按照产品说明进行活化。发酵过程中每隔48 h取样并涂布于WLN固体培养基中，根据酿酒酵母和非酿酒酵母在WLN 平板上菌落形态进行分类统计，并计数。

1.3.2 实验处理

对照组：只接种单一的酿酒酵母（CK）；不接入任何酵母（自然）。

混菌发酵组：葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母1∶1同时接种发酵（CH1）；葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母10∶1同时接种发酵（CH10）；葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母1∶1顺序接种发酵（SH1）；葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母10∶1顺序接种发酵（SH10）；发酵毕赤酵母与酿酒酵母1∶1同时接种发酵（CP1）；发酵毕赤酵母酵母与酿酒酵母10∶1同时接种发酵（CP10）；发酵毕赤酵母酵母与酿酒酵母1∶1顺序接种发酵（SP1）；发酵毕赤酵母与酿酒酵母10∶1顺序接种发酵（SP10）；毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母1∶1同时接种发酵（C7351）；毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母10∶1同时接种发酵（C73510）；毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母1∶1顺序接种发酵（S7351）；毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母10∶1顺序接种发酵（S73510）。

其中酿酒酵母的接种量为1h10CFU/mL；非酿酒酵母的接种量为1∶1（1h10CFU/mL）、10∶1（1h10CFU/mL）；同时接种指同时加入非酿酒酵母与酿酒酵母进行乙醇发酵；顺序接种指先加入非酿酒酵母，48 h后加入酿酒酵母进行乙醇发酵。

1.3.3 葡萄酒酿造工艺

‘赤霞珠’酿酒葡萄除梗破碎后分装于10 L玻璃发酵罐，除自然发酵外，其余酒样加入偏重亚硫酸钾50 mg/L和二甲基二碳酸盐600 mg/L进行过夜灭菌处理，第2天按组接种相应的酵母启动乙醇发酵，乙醇发酵结束（残糖小于4 g/L）1 d后浸渍，分离后取自流汁转入5 L玻璃瓶并进行苹果酸-乳酸发酵（10 mg/L的乳酸菌），苹果酸-乳酸发酵结束加入50 mg/L SO终止发酵并满罐密封贮存，静置1 个月后分离沉淀并装瓶于恒温地下酒窖瓶储，陈酿3 个月后对各发酵组取样进行理化指标分析、挥发性香气成分测定、香气感官评价。每个处理重复2 次。

1.3.4 理化指标检测

参考GB/T 15038ü2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，测定总糖、残糖、总酸、挥发酸、干浸出物含量和乙醇体积分数等理化指标；甘油、苹果酸含量用葡萄酒全自动分析仪测定。

1.3.5 挥发性成分测定

使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对葡萄酒香气成分进行检测，检测方法参考白雪菲等的研究略作改动。

挥发性物质定性定量分析：提取挥发性成分质谱图，通过NIST 17谱库进行检索，并根据C～C烷烃混合标准品的保留时间，用保留指数（retention index，RI）法计算各香气成分的RI从而进行定性分析。香气成分质量浓度以香气成分峰面积与内标峰面积的比值，再乘内标质量浓度进行定量计算。

1.3.6 葡萄酒感官评价

葡萄酒感官品评小组由宁夏大学葡萄酒专业老师和学生组成，共15 名（8 名男性，7 名女性），每名品尝员均经过专业品评培训。以盲品的形式，在标准品酒室（ISO 8589ü1998）使用标准品酒杯（ISO 3591ü1997）品鉴，品尝员需从Davis香气轮盘中选取合适的词汇进行葡萄酒香气特征描述，并按照强度等级（1～8 级）对特征香气进行强度打分。其中Davis香气轮盘包括果香味、花香味、坚果味等12 种香气大类，29 种香气小类，共包括120 种香气类型，可供品尝员进行选择。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Office 2016软件进行数据统计；SPSS 26软件对不同发酵处理酒样的理化指标及挥发性香气成分进行单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），Duncan法进行事后多重比较，＜0.05，差异显著；对气味活性值（odor activity value，OAV）大于0.1的37 种香气成分进行主成分分析（principal component analysis，PCA），其中每组挥发性组分的OAV是由该物质的含量除以其阈值得到；用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的生长变化分析

如图1A所示，CK中酿酒酵母的数量呈先上升后下降的趋势，在第6天达到最大数量，为2.23h10CFU/mL。随着发酵的进行，最终稳定在较高数量级（10～10CFU/mL）直到发酵结束。在自然发酵中，非酿酒酵母与酿酒酵母始终共存，并且在发酵初始阶段非酿酒酵母的数量比酿酒酵母多100 倍左右，其数量在前6 d不断上升并处于主导地位，这与前人研究结果一致。图1B为接种葡萄汁有孢汉逊酵母的处理，可以发现，在顺序接种（SH1、SH10）中葡萄汁有孢汉逊酵母始终存在于发酵体系中，而在同时接种（CH1、CH10）中则于14～16 d完全消失。如图1C所示，只有SP10中的发酵毕赤酵母才能存在至发酵结束，而SP1、CP1和CP10中发酵毕赤酵母在12～14 d完全消失。如图1D所示，无论是哪种接种方式，毕赤克鲁维酵母都在发酵中后期完全消失。可见，不同非酿酒酵母与酿酒酵母之间的竞争能力存在差别，其中葡萄汁有孢汉逊酵母明显强于发酵毕赤酵母，而毕赤克鲁维酵母的活性最差。

图1 不同发酵体系中酿酒酵母与非酿酒酵母细胞的生长变化情况Fig.1 Growth status of S.cerevisiae and non-Saccharomyces yeasts in different fermentation systems

同时接种最能反映酵母之间的竞争能力强弱，CH1和CH10中葡萄汁有孢汉逊酵母的数量最大值（1.9h10、7.23h10CFU/mL）明显大于CP1和CP10中发酵毕赤酵母（1.37h10、1.27h 10CFU/mL），大于C7351和C73510中毕赤克鲁维酵母的数量（1.43h10、1.25h10CFU/mL）。导致非酿酒酵母生长受限的原因有很多，如酿酒酵母能够产生抑制物如乙醇、中链脂肪酸、杀伤毒素和多肽等。此外，对氮源的竞争也会影响各酵母之间的相互作用，有研究发现酿酒酵母能更快、更有效地利用基质中的氮源。实验中还发现所有顺序接种发酵中酿酒酵母的最大数量均低于CK，这可能是由于酿酒酵母迟于非酿酒酵母48 h接种，而在发酵前两天的氮源被非酿酒酵母消耗，导致酿酒酵母的生长受到抑制，并且越高比例接种抑制作用越明显，尤雅等也发现了相似的结果。

综上所述，在贺兰山东麓‘赤霞珠’干红葡萄酒的酿造过程中，酿酒酵母是主导整个发酵进程的菌属，并与非酿酒酵母存在相互竞争关系，当这些非酿酒酵母在前期存在的数量较多时会限制酿酒酵母的生长，相反的当酿酒酵母在前期数量较多时也会限制非酿酒酵母的生长。不同的接种方式会影响非酿酒酵母的作用时间，顺序接种发酵中非酿酒酵母几乎可以存在贯穿整个发酵进程，而同时接种时非酿酒酵母会较快消失。

2.2 葡萄酒基本理化指标分析

发酵结束后的理化指标如表1所示，所有酒样均完成乙醇发酵，残糖质量浓度都低于4 g/L，乙醇体积分数范围为12.28%～14.18%。前人研究发现大多数非酿酒酵母产乙醇的水平较低，如葡萄汁有孢汉逊酵母每消耗19 g/L以上的糖才能够产生1%乙醇，并且在混菌发酵中能使葡萄酒中乙醇产量降低1.21%。本实验发现有非酿酒酵母参与发酵的酒样（自然发酵和混菌发酵），最终乙醇含量均低于CK，降醇幅度可达0.33%～1.9%。此外还发现接种比例对乙醇含量影响不大，影响较大的是接种时间，顺序接种（非酿酒酵母存活时间较长）降醇效果明显高于同时接种，这一结果与尤雅等的研究一致。乙醇产量的减少可能是由于非酿酒酵母的氧化代谢消耗葡萄糖不形成乙醇，而通过其他代谢途径转化为甘油等化合物。

表1 发酵结束后酒样的基本理化指标Table 1 Basic physicochemical parameters of wines measured at the end of fermentation

甘油可以使葡萄酒的口感更加圆润，与CK相比，其余所有酒样的甘油质量浓度增加了0.38～1.11 g/L，其中S73510甘油质量浓度增加了1.11 g/L，CP10增加甘油含量4.6%。研究表明，许多非酿酒酵母能够产生大量的甘油，如毕赤克鲁维酵母在提前48 h和96 h顺序接种的混菌发酵中，甘油质量浓度分别增加了0.33 g/L和1.3 g/L。所有酒样的干浸出物质量浓度在25.4～34.15 g/L之间，其中发酵毕赤酵母参与发酵的酒样干浸出物含量显著高于CK，CP10显著增加干浸出物含量23.6%。

挥发酸是由微生物产生的腐败代谢产物之一，对葡萄酒风味产生负面影响。实验发现自然发酵与顺序接种发酵可以显著增加葡萄酒中挥发酸含量。其中SH10与自然发酵酒样的挥发酸含量与对照相比增加了87%和70%。只有较低比例同时接种的混菌发酵模式（CH1、CP1和C7351）才能够降低挥发酸含量。申静云等同样发现葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母同时接种于威代尔葡萄醪中时，可以明显降低乙酸含量26.90%。国标对干红葡萄酒挥发酸质量浓度 要求是小于1 g/L，挥发酸含量过高可能会给葡萄酒带来一定的溶剂味和酸败感，本实验酒样均在标准范围内。

2.3 香气成分分析

葡萄酒香气是由来源于葡萄本身的挥发性化合物（品种香气）、微生物代谢形成的化合物（发酵香气）以及在葡萄酒陈酿过程形成的化合物（陈酿香气）共同组成的。数百种化合物共同组成了葡萄酒的香气，质量浓度0.1 µg/L～100 mg/L不等。一般来说，葡萄酒可以由这些不同浓度的挥发性物质区分，这些挥发性化合物受所使用酵母的类型和发酵条件的影响，最终对葡萄酒的香气品质产生正面或负面的影响。

发酵结束后对各个酒样进行挥发性香气成分的测定及分析，结果如表2所示，列出了香气成分的含量、阈值以及香气特征。共测得48 种香气物质，其中酯类物质最多，共25 种，包括乙酸酯4 种、乙醇酯15 种和其他酯类6 种。高级醇类物质10 种，脂肪酸类物质5 种，品种香气物质5 种以及其他化合物3 种。这些挥发性香气物质在葡萄酒中的总量为366.06～598.86 mg/L。只有3 种顺序接种发酵酒样（SH1、SH10、S7351）的香气物质含量低于对照（412.92 mg/L），其中SH1酒样中香气成分含量最低（366.06 mg/L）。其余酒样的香气物质含量均高于对照，尤其是CP10的含量最高（598.86 mg/L）。此外，各非酿酒酵母发酵酒样的香气成分总量都表现出相似的两点规律：同时接种的含量高于顺序接种发酵；非酿酒酵母的接种比例越高，挥发性香气物质总含量越高。

表2 不同发酵处理葡萄酒的香气成分Table 2 Volatile compounds of wine obtained by different fermentation treatments

酒样中测得的品种香气共5 种，包括萜烯类化合物2 种（芳樟醇和香茅醇）、降13碳异戊二烯类化合物1 种（-大马士酮）、挥发性酚类1 种（2,4-二叔丁基苯酚）和C化合物1 种（正己醇）。其中芳樟醇、香茅醇和-大马士酮的OAV大于1，可给葡萄酒带来花果香气。芳樟醇与花香、柠檬香呈正相关，实验中所有酒样的芳樟醇含量均大于CK（39.85 μg/L），尤其是C7351增加了78%。检出的43 种发酵香气总量范围为362.8～595.6 mg/L，占相应酒样香气总量的99%以上。其中酯类物质和高级醇类物质占绝大部分，其次是脂肪酸、醛类物质等。

高级醇类物质在葡萄酒香气中占据着不可或缺的位置，是酵母氨基酸代谢的副产物，通常指的是含有2 个以上碳原子的挥发性醇类。高级醇质量浓度低于300 mg/L时能够使葡萄酒的香气更加复杂，但当其总质量浓度超过400 mg/L时，就会给人带来强烈的刺鼻味和不悦感。酒样中高级醇质量浓度在165.2～290.7 mg/L之间，均低于300 mg/L。不同非酿酒酵母对高级醇产量的影响不同，本实验发现同时接种发酵毕赤酵母（CP1、CP10），可以显著提高高级醇物质含量24.5%和28.1%，这与王倩倩等的研究结果相符。顺序接种毕赤克鲁维酵母则会使高级醇含量降低8.4%～15.1%，同样的结果也被Whitener和Benito等证实。多个研究还报道了非

酿酒酵母与酿酒酵母结合的混菌发酵可以提高苯乙醇的含量，进而给葡萄酒带来蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人香味，如毕赤克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母和扁平云假丝酵母等。本研究也发现，无论是哪种接种方式，发酵毕赤酵母都可以提高苯乙醇含量14.3%～40.1%。

续表2

酯类化合物是乙醇发酵产生的典型副产物之一，主要为葡萄酒贡献花香和果香，葡萄酒中的酯类物质绝大多数形成于发酵和陈酿过程，主要包括乙酸酯和乙醇酯等。实验发现赤霞珠酒样中酯类物质的总质量浓度在163.2～299.5 mg/L之间。顺序接种可以增加酯类物质产量，这与张文静等研究结果一致。乙酸苯乙酯是一种特殊的芳香化合物，当其质量浓度超过0.25 mg/L时，能够给葡萄酒增添玫瑰和花的芳香。有发现葡萄汁有孢汉逊酵母能够增加葡萄酒中的乙酸异戊酯与乙酸苯乙酯的含量，本研究也发现了相似的结果。此外利用10∶1接种的毕赤克鲁维酵母（S73510和C73510）能够分别增加乙酸苯乙酯12.4%和31.5%。其他研究也发现毕赤克鲁维酵母能够增加乙酸苯乙酯的含量 25%和60%。

脂肪酸包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，而对葡萄酒香气起重要贡献作用的是饱和脂肪酸。在接近气味阈值的水平，脂肪酸能增加葡萄酒香气的复杂性，提高奶酪、黄油等风味特征。然而在过高的浓度下，它们会使葡萄酒产生“汗味”、“腐臭”和“脂肪”等令人不愉快的气味。较多研究报道，即使是使用相同的非酿酒酵母，但接种时间和接种量不同的情况下也会导致葡萄酒中的挥发性脂肪酸含量有很大差异。本实验发现，在顺序接种葡萄汁有孢汉逊酵母和毕赤克鲁维酵母酵母时，脂肪酸含量下降，在同时接种中，脂肪酸含量反而上升。Hu Kai等研究表明，与纯酿酒酵母发酵相比，利用葡萄汁有孢汉逊酵母顺序接种发酵‘赤霞珠’葡萄酒，脂肪酸含量明显下降，但相同条件下同时接种发酵的葡萄酒，脂肪酸含量上升明显，相同的规律在其他研究中也被发现。

为了更好地区别各处理之间挥发性香气成分的差异，利用Origin 2017软件对所有OAV大于0.1的37 种挥发性香气（包括22 种OAV大于1的物质）成分及不同处理进行PCA，前2 个PC上的香气成分载荷及酒样分布见图2。PC1与PC2 分别占数据总体方差的39.1%和19.0%，总贡献率为58.1%。由于接种菌种及接种时间的不同，各实验组在图上有不同分布，例如对于葡萄汁有孢汉逊酵母而言，由于接种顺序的不同，同时接种发酵组与顺序接种发酵组分别位于图的上下两侧，其中顺序接种的发酵组（SH1、SH10）主要位于PC2的正方向上，而同时接种发酵（CH1、CH10）主要位于PC2的负方向上。对于发酵毕赤酵母而言，同时接种的发酵组（CP1、CP10）主要位于PC2的正方向上，而顺序接种的发酵组（SP1、SP10）主要位于PC2的负方向上。对于毕赤克鲁维酵母而言，顺序接种的发酵组（S7351、S73510）主要位于PC1的正方向上，而同时接种发酵（C7351、C73510）主要位于PC1的负方向上。当接种相同酵母的接种时间一致而接种比例不同时，各样品分布较为贴近。然而，当接种不同酵母或者接种时间不同时，各样品分布较远，如图2A中右上部分中的自然发酵、SH1、SH10与图2B中特征香气如乙酸酯类物质及庚醇、壬醇相关联。图2B左上部分的特征性香气物质最多，包括11 种酯、4 种品种香气、2 种高级醇、1 种脂肪酸和2 种其他化合物，与图2A中CP1、CP10、SP10即发酵毕赤酵母相关联。图2A中左下部分，是由毕赤克鲁维酵母同时接种发酵的发酵方案（C7351和C73510），与特征香气物质脂肪酸、香茅醇、苯乙醇、苯乙酸乙酯相关联。

图2 发酵结束后酒样中OAV大于0.1的香气化合物PCA得分图（A）和载荷图（B）Fig.2 Score (A) and loading plots (B) of PCA for aroma compounds(OAV > 0.1) in wines

2.4 感官品鉴分析

供试酒样香气特征的感官量化分析结果见图3，所有酒样的乙醇味均低于CK，这与理化指标结果相符。除此之外，CK也具有最强的香辛料味。如图3A所示，葡萄汁有孢汉逊酵母的存在可以给葡萄酒带来更多的草本植物香气和花香，其中顺序接种的SH1与SH10可以增加热带水果香气、坚果香气和温带水果香气。但是葡萄汁有孢汉逊酵母也会带来较强的指甲油气味，并且接种比例越高，产生的影响越明显。Hu Kai等的研究同样发现，葡萄汁有孢汉逊酵母在混菌发酵中能够增加花香和热带水果香气，但是由于乙酸酯类物质含量过高导致了异味（指甲油味）的产生。如图3B所示，发酵毕赤酵母的参与提高了‘赤霞珠’葡萄酒的浆果香、热带水果香和花香，降低了指甲油的香气，此外CP10还能够增加坚果和果酱味。王倩倩等也发现发酵毕赤酵母能够显著提高葡萄酒的热带水果香气与花香。如图3C所示，毕赤克鲁维酵母的接入可以增加‘赤霞珠’葡萄酒热带水果、花香和坚果的香气特征，但是降低了温带水果的香气特点。另外，在毕赤克鲁维参与的条件下，完全不能感知到葡萄酒中指甲油味的存在。

图3 ‘赤霞珠’干红葡萄酒感官香气轮廓图Fig.3 Sensory aroma profile of ‘Cabernet Sauvignon’ dry red wine

3 结 论

所有的混菌发酵方案都可以降低‘赤霞珠’葡萄酒的乙醇含量，降低葡萄酒的乙醇味和香辛料味，也能够增加葡萄酒甘油和干浸出物的含量。葡萄汁有孢汉逊酵母能够增加挥发酸含量进而增加指甲油的气味，SH1和SH10与自然发酵相似，显著增加了葡萄酒乙酸酯类挥发性香气物质的含量，给葡萄酒带来较多的花香，但香气物质总量与CK差异不显著。发酵毕赤酵母增加了葡萄酒发酵香气含量，尤其是高级醇和酯类物质，其中同时接种的CP1和CP10香气物质总量不仅显著高于其他组，还为葡萄酒增加了浆果、热带水果、花香和坚果等感官香气强度。毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母同时接种发酵的葡萄酒挥发性香气物质总量显著高于CK，能够增加乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙醇和异戊醇等物质的含量，提高了葡萄酒热带水果、花香和坚果的香气特征。

总体上，混菌发酵可以改变贺兰山东麓‘赤霞珠’葡萄酒的香气风格，各非酿酒酵母给葡萄酒带来的香气特征也各具特点。其中10∶1同时接种发酵毕赤酵母的混菌发酵方案CP10，在确保乙醇发酵顺利完成的同时，增加了葡萄酒中干浸出物与甘油的含量，另外也能够最大程度地发挥其产香特性（与CK相比挥发性香气物质总量提升了45%），所酿造的‘赤霞珠’葡萄酒香气物质最为丰富。因此，本研究认为CP10的接种方案对贺兰山东麓‘赤霞珠’葡萄酒具有增香酿造的应用潜力。在后期研究中，将进一步细化发酵毕赤酵母与酿酒酵母的相互作用关系、调控其他工艺参数以确定一套完整的混菌发酵方案，以期为贺兰山东麓‘赤霞珠’葡萄酒酿造工艺技术的研发提供理论依据。