跨越式滚环等温扩增技术结合CRISPR/Cas12a定量检测海产品中的副溶血性弧菌

董换哲，苑 宁，张蕴哲，杨 倩,3,*，卢 鑫，郭 威，张 伟,4,5,*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学理工学院，河北 沧州 061100；3.河北大学公共卫生学院，河北 保定 071002；4.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001；5.河北省人畜共患病原微生物分析与防控重点实验室，河北 保定 071001）

副溶血性弧菌（）是一种广泛存在于各种海产品中的食源性致病菌。在我国沿海地区，副溶血性弧菌是发生细菌性食源性疾病的主要致病菌。食用受副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海产品，可能会引起人类患胃肠道疾病，其临床症状包括腹泻、腹部痉挛、呕吐、发烧或发冷。此外，副溶血性弧菌也可通过开放性伤口传播，甚至可导致败血症，严重时可危及生命。根据GB 29921ü2013《食品中致病菌限量》规定，海产品中副溶血性弧菌含量应低于10CFU/g，从而降低由副溶血性弧菌引起的感染风险。因此，为有效监测食品安全问题，开发快速且灵敏的副溶血性弧菌定量检测方法具有重要现实意义。

传统培养方法、免疫学方法、核酸扩增技术等是目前国内外检测副溶血性弧菌的主要方法。传统培养方法对副溶血性弧菌的检测准确、可靠，但至少需要3～5 d才能获得最终结果，且灵敏度低，在快速检测中应用受限；免疫学检测方法易受食品基质影响，从而导致该方法灵敏度较低、特异性较差；核酸扩增技术中的核酸等温扩增反应在同一温度下对靶标进行快速扩增，对仪器要求较低，通过金属浴、水浴锅等简单的设备即可完成反应。本实验室研究团队基于酶扩增DNA的一种新特性，创建了跨越式滚环等温扩增技术（saltatory rolling circle amplification，SRCA）。SRCA无需人为环化模板，在等温条件下仅需1 对引物便可完成对线性DNA的扩增，是一种新型核酸等温扩增技术。

成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相关蛋白（CRISPR associated protein，Cas）组成了CRISPR/Cas系统，是细菌和古细菌中的一种获得性免疫机制。最近的研究发现，Cas12a可在CRISPR RNA（crRNA）引导下靶向结合双链DNA，产生对单链DNA（single strand DNA，ssDNA）的非特异切割活性。由于CRISPR/Cas12a系统特异性识别以及裂解DNA序列的能力，近年来被用于开发新型核酸检测平台。

基于此，本研究将SRCA扩增反应与CRISPR/Cas12a系统结合，建立一种检测副溶血性弧菌的新方法。检测原理如图1所示，首先利用SRCA反应进行核酸扩增，产生许多串联重复的靶标序列；然后利用设计的crRNA特异性识别扩增靶标，从而使Cas12a产生对ssDNA的切割活性。利用此特性切割体系内ssDNA报告探针，使得修饰在探针两端的荧光基因和猝灭基团远离发出荧光信号，最后通过荧光信号变化判定结果，从而建立SRCACas12a检测方法，并将该方法应用到海产品中副溶血性弧菌的定量检测。

图1 SRCA-Cas12a检测副溶血性弧菌原理图Fig.1 Schematic illustration of the principle of SRCA-Cas12a for the detection of V.parahaemolyticus

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

副溶血性弧菌（CICC 21617、CICC 21528、ATCC 17802）、溶藻弧菌（CICC 21664）、创伤弧菌（CICC21615）、大肠埃希氏菌（CMCC 44103）、鼠伤寒沙门氏菌（CMCC 50115）、肠炎沙门氏菌（CMCC 50041）、单核细胞性李斯特菌（CMCC 54001）、金黄色葡萄球菌（CMCC 26003）、福氏志贺菌（ATCC 12022）、宋内氏志贺菌（CMCC 51334）、铜绿假单胞杆菌（CICC 21636）均由本实验室提供保藏；本研究所用序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳进行纯化）；细菌全基因组DNA提取试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；DNA聚合酶、Cas12a蛋白 美国NEB有限公司；dNTPs、无酶无菌水 北京博迈德基因技术有限公司；所有溶液均采用无酶无菌水配制。

1.2 仪器与设备

DK-8D三孔电热恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司；Nanodrop 2000分光光度计 美国Thermo Scientific有限公司；DXY-33A型电泳仪 北京六一仪器厂；JY04S-3E凝胶成像仪 北京君意电泳设备有限公司；F-320荧光分光光度计 天津港东科技发展股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养及核酸提取

副溶血性弧菌在3%氯化钠碱性蛋白胨水中培养，其他菌株在LB培养基中培养，过夜培养得到菌悬液，按照细菌全基因组DNA提取试剂盒说明书，取1 mL菌悬液提取DNA。

1.3.2 引物设计

选取副溶血性弧菌的基因为特异性靶基因，通过BLAST同源性比对后，选取的副溶血性弧菌GenBank序列号为L11929.1。利用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计SRCA反应的正向引物和反向引物，引物序列信息见表1。

表1 序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study

1.3.3 SRCA扩增反应

SRCA预反应体系为20.0 mmol/L Mg3.0 µL、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 µL、10hThermoPol Reaction Buffer 2.0 µL、模板DNA 1.0 µL、10.0 µmol/L正、反向引物各1.0 µL、DNA聚合酶（8 000 U/mL）1.0 μL，添加无酶无菌水将体系补足至20.0 µL，62 ℃反应50 min。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.3.4 crRNA以及ssDNA报告分子的合成

crRNA由直接重复序列和间隔序列组成，在CRISPR/Cas12a系统中，形成茎环结构的直接重复序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU，间隔序列与检测序列互补。在副溶血性弧菌检测序列中找到一个用于激活Cas12a蛋白的富含T核苷酸的原间隔邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）（TTTN，N代表A、T、G或C），crRNA的间隔序列与PAM的下游序列（约21 bp）相同，其中T被U取代。ssDNA报告分子选用FAM和BHQ1探针分别修饰两端。crRNA及ssDNA的序列信息见表1。

1.3.5 CRISPR/Cas12a剪切反应

CRISPR/Cas12a检测体系包括1.0 µmol/L Cas12a 1.0 µL、1hNEBuffer 5.0 µL、1.0 µmol/L crRNA 5.0 µL、1.5 µmol/L ssDNA报告分子5.0 µL、SRCA扩增产物5 µL，添加无酶无菌水将体系补足至50.0 µL，37 ℃反应15 min，反应结束后取出反应样品移至荧光比色皿中，荧光分光光度计设置激发波长为492 nm，发射波长为510～700 nm，进行荧光光谱检测。以有靶标时的荧光强度与无靶标时的荧光强度的比值表示。

1.3.6 SRCA-Cas12a条件优化

为进一步优化检测性能，分别优化ssDNA探针浓度、Cas12a/crRNA浓度比、Cas12a剪切反应时间。ssDNA探针浓度设置6 个梯度，依次为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 µmol/L。固定Cas12a浓度为1 µmol/L，Cas12a/crRNA浓度比设置8 个梯度，依次为2∶1、4∶3、1∶1、4∶5、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3。Cas12a剪切反应时间依次设置为5、10、15、20、25、30 min。

1.3.7 SRCA-Cas12a检测灵敏度

将培养的副溶血性弧菌菌液进行10 倍梯度稀释，同时取各稀释度菌液1 mL提取基因组DNA，利用SRCACas12a方法对各稀释度的基因组DNA进行检测，确定方法的灵敏度。

1.3.8 SRCA-Cas12a特异性

使用细菌全基因组DNA提取试剂盒提取3 株副溶血性弧菌以及10 株非副溶血性弧菌的DNA。采用SRCACas12a方法进行检测，同时以无酶无菌水作为空白对照，分析方法的特异性。

1.3.9 人工污染样品中副溶血性弧菌的检测

将培养的副溶血性弧菌菌液进行10 倍梯度稀释，选择适宜稀释度进行平板计数，每个稀释度3 个平行。分别取不含副溶血性弧菌的虾肉样品和牡蛎样品5 g，接入不同稀释度的副溶血性弧菌。将接种后的样品加入45 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中混合均匀，取1 mL均质液提取DNA后使用SRCA-Cas12a方法进行检测。

1.3.10 实际样品检测

从超市采集水产品36 份，样品清单见表2。分别采用GB 4789.7ü2013《食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》方法以及SRCA-Cas12a方法进行检测，验证SRCACas12a方法在实际样品检测中的应用能力。分别根据式（1）～（3）确定敏感性、特异性和符合率：

表2 36 份实际样品清单Table 2 List of 36 actual samples tested in this study

分别取25 g实际样品加入225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中混合均匀，按照GB 4789.7ü2013方法经增菌、选择性分离、纯培养及生化鉴定后判定结果。

取1 mL上述增菌液提取基因组DNA，所提取的基因组DNA作为SRCA-Cas12a方法的检测模板，根据荧光信号判定所构建荧光传感器的检测结果。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 可行性验证

根据实验原理，可行性验证主要分为SRCA扩增反应和剪切反应。

SRCA扩增产物为靶标序列和添加序列的串联重复序列，所设计的SRCA目的序列长度为80 bp，如图2a所示，SRCA扩增产物的凝胶电泳结果与反应原理一致。

Cas12a剪切反应的完整体系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA报告分子以及靶标，只有当体系完整时才能检测到荧光信号，因此设置各组分分别缺失的对照，即Cas12a＋crRNA＋靶标、Cas12a＋靶标＋ssDNA、Cas12a＋crRNA＋ssDNA、crRNA＋靶标＋ssDNA以及完整体系Cas12a＋crRNA＋靶标+ssDNA共5 组反应体系进行荧光检测。如图2b所示，只有在体系完整的情况下，才能形成Cas12a-crRNA-靶标三元复合物，从而观察到较强的荧光信号。因此，SRCA扩增反应和Cas12a剪切反应的结果表明，所设计的SRCA-Cas12a方法可以用于副溶血性弧菌的检测。

图2 可行性验证Fig.2 Feasibility verification

2.2 条件优化

探针是观察荧光强度的关键因素，因此，本研究对ssDNA探针浓度进行优化，从而保证探针的使用效率。如图3a所示，当ssDNA探针浓度从0.5 µmol/L增加到1.5 µmol/L时，/变化明显；当ssDNA探针浓度从1.5 µmol/L增加到3.0 µmol/L时，/变化缓慢。因此，本研究选取1.5 µmol/L为探针的最优反应浓度。

反应时间的长短会影响检测速率的快慢。如图3b所示，当反应时间为5～15 min时，/逐渐增加；当反应时间为15～30 min时，反应进入平台期。综上，本研究选取15 min为最优反应时间。

在Cas12a剪切反应中，Cas12a-crRNA二元复合物形成量决定了剪切反应的速率。二元复合物形成量过少，影响剪切反应效率，不利于实验进行；二元复合物形成量过多，增加实验成本，造成不必要的浪费。如图3c所示，当Cas12a与crRNA浓度比为1∶1时，/最大。综合考虑，本研究中Cas12a/crRNA最优浓度比为1∶1。

图3 反应条件优化Fig.3 Optimization of reaction conditions

2.3 线性范围与检出限结果

通过平板计数得出副溶血性弧菌初始菌液浓度为1.7h10CFU/mL。使用SRCA-Cas12a对不同稀释度的副溶血性弧菌进行检测，如图4所示，荧光信号强度随着菌液浓度的降低而降低。当副溶血性弧菌菌液浓度为1.7h10～1.7h10CFU/mL时，菌液浓度的对数与荧光信号强度变化（/）存在线性关系，线性方程为=1.847 2＋2.473 8（=0.986 6），线性关系良好，检出限为3.6 CFU/mL（=3）。结果表明，SRCA-Cas12a可实现对副溶血性弧菌的定量检测。

图4 SRCA-Cas12a方法的灵敏度Fig.4 Sensitivity of SRCA-Cas12a

2.4 特异性实验结果

为验证SRCA-Cas12a检测副溶血性弧菌的特异性，选取3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌进行特异性实验。如图5所示，副溶血性弧菌产生的荧光信号强度明显高于其他食源性致病菌产生的荧光强度。结果表明，所设计的crRNA可以特异性识别SRCA扩增产物，从而使Cas12a产生对ssDNA的非特异切割活性，ssDNA两端的荧光基团和猝灭基团远离，荧光强度增强。相反，其他食源性致病菌不能激活Cas12a的切割活性，荧光猝灭不会恢复。因此，SRCA-Cas12a该方法具有良好的特异性。

图5 SRCA-Cas12a方法的特异性Fig.5 Specificity of SRCA-Cas12a

2.5 人工污染样品中副溶血性弧菌的检测

为验证SRCA-Cas12a方法检测的准确性，测定虾肉和牡蛎空白样品的加标回收率。由表3可知，人工污染样品的加标回收率在95.5%～104.4%之间，相对标准偏差为1.7%～5.2%，表明该方法检测结果准确可靠。

表3 人工污染样品中副溶血性弧菌的检测（n=5）Table 3 Results of determination of V.parahaemolyticus in artificially contaminated samples (n = 5)

2.6 实际样品检测结果

使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分别对采集的36 份海产品进行检测，并比较这2 种方法，检测结果如表4所示。GB 4789.7ü2013方法阳性样品检出数为15 个，阴性样品检出数为21 个；SRCA-Cas12a方法阳性样品检出数为16 个，阴性样品检出数为20 个。以GB 4789.7ü2013方法检测结果为标准，SRCA-Cas12a方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率达到97.2%。因此，SRCA-Cas12a方法在实际样品检测中有一定的应用能力。

表4 实际样品检测结果Table 4 Results of detection of actual samples by SRCA-Cas12a and conventional culture method

3 讨 论

将SRCA扩增反应与CRISPR/Cas12a系统相结合，建立了一种检测海产品中副溶血性弧菌的新方法。SRCA作为一种新型核酸等温扩增技术，可对靶标序列快速扩增实现信号放大，同时也可作为对靶标序列的第1重识别。CRISPR/Cas12a系统中crRNA通过PAM序列与SRCA扩增产物中大量重复的靶标序列结合，从而对靶标序列二次识别，激活Cas12a的非特异切割活性。研究表明Cas12a的切割速率达到250 次/s。因此，将CRISPR/Cas12a系统与SRCA结合提高了检测的灵敏度和特异性。该方法对副溶血性弧菌的线性检测范围为1.7h10～1.7h10CFU/mL，检出限为3.6 CFU/mL。对3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌进行特异性实验的结果表明，该方法具有良好的特异性。利用SRCA-Cas12a方法进行加标回收率实验，样品的加标回收率在95.5%～104.4%之间。使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分别对采集的36 份海产品进行检测，结果可得SRCA-Cas12a方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率为97.2%。此外，由于CRISPR/Cas12a系统的可编程性，该检测方法可针对不同靶标分子设计引物和crRNA，从而实现对其他食源性致病菌的检测。并且该方法在现场检测时可以选择小型的荧光观察装置，通过肉眼观察结果。同时，在今后研究中探索基于SRCA-Cas12a方法的多重核酸检测方法，有望使CRISPR/Cas系统在多重核酸检测领域得到应用。

综上所述，SRCA-Cas12a方法具有灵敏度高、特异性强的优点，为副溶血性弧菌的快速定量检测提供了一种新策略，也为其他食源性致病菌的检测提供新思路，对保障食品安全具有重要的现实意义和参考价值。