孕早期血清人组织激肽释放酶结合蛋白对早发型子痫前期的预测价值

周娃娃，符爱贞，高梅

子痫前期(preeclampsia，PE)是一种人类胎盘疾病，同时伴有母体多种器官系统反应[1]。虽然PE的病因尚未完全阐明，但血管功能障碍导致胎盘功能不良(包括功能障碍和无序的新生血管形成)被认为是其主要原因[2]。人组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin，KS)是一种主要由肝脏合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)[3]，它在抑制组织激肽释放酶的同时，其活性部分可刺激内皮一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、人沉默调节蛋白1(sirtuin 1,SIRT1)和细胞因子信号传导抑制因子-3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)的表达[4-6]。因此，一些基础和人体研究都证实KS具有抑制炎症、氧化应激、细胞凋亡和血管生成以及血管舒张功能，例如通过修复血管损伤和强大的扩血管作用，对肺动脉高压[7]、肾实质性高血压[8]等都具有一定的保护机制。基于KS在降压和血管系统中的作用，推断其与PE的相关病理学有关。因此本研究旨在分析PE患者和正常妊娠人群血清KS水平在孕早期时的差异，并进一步评估血清KS水平预测早发型子痫前期(early onset preeclampsia，EOPE)的价值，从而为寻找可靠的生物标志物及潜在的PE治疗靶点提供证据支持。

1 资料和方法

1.1 研究对象

回顾性分析2020年3～11月在海口市妇幼保健院产科门诊建档、接受常规检查和分娩，且追踪随访确诊的110例PE患者的临床和实验室参数，根据PE类型分为55例EOPE(EOPE组，34孕周之前发生)和55例晚发型PE(LOPE组，34孕周之后发生)。另外按照1∶1比例招募与研究对象孕周(±1周)相匹配、无任何妊娠并发症且适于胎龄儿的55例孕妇作为对照组。纳入标准：18～40岁单胎妊娠女性，自愿参与本研究，产检和分娩资料完整。排除标准：<18岁和>40岁的女性，有炎症性肠病、血管炎、风湿性疾病等炎症性疾病史的女性；合并急性或慢性感染者；多胎妊娠；任何胎儿染色体或发育异常；孕产妇系统性疾病，如妊娠期糖尿病、已知的高血压疾病、已知的肝脏、肾脏和肾上腺疾病；胎膜早破；已经进入第二产程的孕妇。该研究方案得到我院伦理委员会的批准，遵守世界医学协会赫尔辛基宣言关于人类受试者和/或动物研究的道德行为。

1.2 PE诊断标准

既往没有高血压病史的孕妇在20孕周产检时测量2次动脉压(至少间隔4 h)≥140/90 mmHg，且符合以下一项或多项标准则可诊断为PE[9]：① 24 h尿蛋白≥300 mg或蛋白/肌酐比值≥30 mg/mL；② 急性肾损伤的生化或临床体征(肌酐≥90 μmol/L或1 mg/dL)或肝脏受累(丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶>40 IU/L)或神经系统并发症，如子痫、精神状态改变、失明、中风、痉挛、严重头痛、持续性视觉暗点或血液学并发症(血小板计数<150×109/L、弥散性血管内凝血、溶血)；③ 多普勒检查证实宫内生长迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)或子宫胎盘循环受损或胎儿死亡[1]。

1.3 检测指标

在入组时记录孕妇的临床特征和生化结果。血液参数包括全血细胞计数(complete blood count,CBC)、血清电解质、肝酶、尿酸、胆红素、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐和血清KS。采集5～13孕周孕妇的外周血。孕龄根据最后1次月经周期和妊娠头3个月的超声波顶臀长来计算。在给予任何药物前用乙二胺四乙酸或血清管采集外周静脉血标本。收集样品后30 min内，在2～8°C下1 000 r/min离心15 min。立即置于-80℃保存直至进行生化检查。将样品解冻，使用KS酶联免疫吸附测定试剂盒(SL3025Hu，中国Sunlong Biotech公司)定量测定血清样KS含量。在标准全波长酶标仪(美国Thermo Scientific公司)上读取450 nm波长处的光密度值。检测范围为1 ～ 80 ng/mL，灵敏度为0.1 ng/mL。

1.4 子宫动脉多普勒检测

于妊娠22～24周时，使用GE Voluson E10彩色多普勒超声诊断系统(美国GE医疗公司)进行子宫动脉多普勒超声扫描。将传感器沿腹股沟管放置。利用彩色多普勒二维超声显像，确定子宫外侧髂外血管和子宫血管。子宫动脉以大约90°的角度穿过髂外血管。从子宫动脉近端应用脉冲波多普勒超声。波形与血管之间的共振角度保持在0°左右(<30°)。获得3个连续完整的波形，计算平均搏动指数(pulsatile index,PI)，注意是否存在舒张早期切迹(图1，见彩插1)。子宫动脉多普勒异常表现为平均PI>相应孕周PI值的95个百分位。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 3组孕妇基线资料比较

EOPE组孕妇血清KS水平低于对照组，子宫动脉PI值、收缩压及单双侧存在舒张早期切迹的比例高于对照组，且分娩孕周相对更早，差异均有统计学意义(P<0.05)。EOPE组孕妇甘油三酯高于LOPE组，血清KS水平则低于LOPE组(P<0.05)，LOPE组孕妇血清KS水平和子宫动脉PI值与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 3组孕妇人口统计学、临床和实验室特征

2.2 ROC曲线分析血清KS预测EOPE的临床价值

基于ROC曲线，血清KS预测EOPE的最佳截断值为28.60 ng/mL(AUC=0.725,95%CI：0.603-0.848，P<0.001)。使用血清KS≤28.60 ng/mL预测EOPE时，敏感性为59.1%，特异性为87.4%，阳性预测值(positive predictive value,PPV)为19.7%，阴性预测值(negative predictive value,NPV)为97.6%，见下页图2。

图2 血清KS用于预测EOPE时的ROC曲线

2.3 多因素Logistic回归分析预测EOPE发生风险的临床因素

以EOPE作为因变量，将舒张早期切迹(单侧和双侧)、血清KS、甘油三酯和其他混杂因素(年龄、采血孕周)纳入回归模型，经多因素Logistic回归分析，舒张早期切迹(单侧和双侧)、血清KS≤28.60 ng/mL是预测EOPE风险的独立危险因素(P<0.05)，详见下页表2。

表2 多因素Logistic回归分析预测EOPE发生风险的临床因素

2.4 ROC曲线分析血清KS和子宫动脉平均PI值对EOPE的预测价值

经ROC曲线分析，血清KS≤28.60 ng/mL联合子宫动脉平均PI>相应孕周PI值的95个百分位用于预测EOPE的敏感度、特异度、PPV、NPV、似然比(likelihood ratio,LR)详见表3。

表3 ROC曲线分析血清KS和子宫动脉平均PI值对EOPE的预测价值

3 讨论

虽然PE的确切病理生理学机制尚不清楚，但目前公认的发病机制包括胎盘灌注不良、血管生成不平衡以及胎盘炎症因素等[10]。滋养细胞侵入螺旋动脉的过程受损，导致胎盘灌注不良。子宫动脉总外周阻力增加表明绒毛间隙血管重塑失败[11]。系统观察表明，子宫动脉PI值单独增加和/或联合舒张早期切迹是预测PE较好的指标，但是在孕早期的灵敏度有限[12]。本研究数据也证实了这一点，ROC曲线得到的灵敏度仅为5.7%，但特异性很高。而子宫动脉多普勒超声和/或血清KS用于预测EOPE，则很好地提高了敏感性，说明结合子宫动脉多普勒和生化标志物可以更好地预测EOPE，但是对于LOPE几乎没有预测价值。

在生理性妊娠中，血管舒张功能的正常发挥至关重要，这主要与NO通路正常有关[13]。NO通路在排卵、着床、子宫血管重塑、调节周围血管阻力和血管反应活性等方面具有重要作用。此外NO通路在缺乏自主神经支配的胎盘中具有自分泌和旁分泌作用，并可调节胎盘循环[14]。预防性给予NO供体季戊四醇四硝酸酯可降低孕中期胎盘灌注异常的女性发生IUGR的风险[15]。虽然PE的病理生理学不能完全解释，但母体血管功能障碍的存在是PE的基础。与LOPE相比，EOPE与导致灌注不足的胎盘病变具有更高的相关性[16]。体内和体外研究表明，NO信号通路异常与PE的发展及其严重程度之间存在密切关联[2,17]。在PE患者中，NO生物利用度降低，抑制NOS和抗血管生成因子的相关分子分泌增加[2]。由于KS可通过其活性部分诱导NOS，因此PE患者血清KS水平的降低可导致NO合成减少。

从分子机制分析，KS结构中的活性部分可刺激SIRT1和SOCS-3。SIRT1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性蛋白脱乙酰酶家族的成员，是一种营养传感器。研究发现，SIRT1在胎盘发育和滋养层分化中发挥重要作用[18]。SIRT1在缺氧病例中表达增加，在炎症和氧化病例中表达减少，例如PE患者的胎盘组织中[18-19]。这种减少与PE患者胎盘滋养层能量不足导致的寿命缩短有关。此外SOCS-3可抑制IL-6、瘦素和促红细胞生成素。SOCS-3在PE患者母体内皮细胞、白细胞和胎盘滋养细胞中的表达减少，被认为与改变了细胞因子信号、导致炎症反应增加有关[20]。在动物实验中，高血压大鼠血清KS较正常大鼠普遍降低，静脉给药后，高血压大鼠和正常大鼠的血压都能迅速但暂时下降。即使在转基因大鼠中，给予外源性KS也能降低血压[21]。除了降压作用外，给予外源性KS还会引起孤立性主动脉环患者血管舒张，但是不能消除艾替班特(激肽B2受体拮抗剂)引起的血压降低和血管舒张，表明KS对血压的影响与组织激肽释放酶-激肽系统无关[22]。然而，给予NOS抑制剂(Nω-硝基-L-精氨酸甲酯，L-NAME)可阻断KS的扩血管效应。这表明，KS的血管扩张作用与内皮NOS表达增加和激活相关的NO生成有关。因此在本研究中，EOPE孕妇血清KS水平降低可能预示着SIRT1和SOCS-3刺激减少，导致NOS活性和NO生成的降低，胎盘滋养层能量供应不足且炎症反应增加，最终导致胎盘寿命缩短。

KS在妊娠中的作用是目前国内一个鲜有人关注的方面。Chao J等[23]曾观察到21例孕妇的血浆KS水平低于30名健康女性和男性。这种下降是由于怀孕期间产量减少或血浆稀释增加。而我们研究的主要优势是对EOPE和LOPE孕妇进行了血清KS评估，并证实检测孕早期血清KS水平可提高子宫动脉PI值和舒张早期切迹对于EOPE预测的灵敏度。但局限性在于病例样本偏少，KS在PE中的作用机制尚不明确。

综上，与孕龄匹配的对照组相比，EOPE孕妇孕早期血清KS水平普遍降低，同时也低于LOPE孕妇。而低血清KS水平预示着孕妇EOPE风险增加，检测孕早期血清KS水平可提高子宫动脉PI值和舒张早期切迹预测EOPE的灵敏度。但是KS对PE患者的降压作用机制还有待进一步研究。