柴胡疏肝散“异病同治”治疗抑郁症、失眠障碍及偏头痛作用机制的网络药理学研究

刘 毅，李 菲，贾跃进，郝世飞

抑郁症(depression disorder，DD)、失眠障碍(insomnia disorder，ID)和偏头痛(migraine)都是神经系统常见疾病，可对人们身心健康造成很大的危害[1]，研究显示，这些疾病常伴发为合并病[2]，并可相互诱发、促进，其发病机制存在关联，临床用药也有交集[1，3-6]。尽管目前现代医学对于这些疾病有多种可供选择的药物，但仍缺乏理想药物[7-9]。中医药具有整体性以及多靶点、多途径发挥作用的特点，临床应用安全有效，因此，挖掘中医药可为抑郁症、失眠障碍、偏头痛的药物治疗提供思路与参考。

柴胡疏肝散出自《医学统旨》，由柴胡、川芎、白芍、枳壳、陈皮、甘草、香附七味中药组成，是疏肝理气的代表方剂，临床常用于治疗包括神经系统、消化系统、循环系统、内分泌系统疾病在内的多种疾病[10]。其中神经系统疾病主要以抑郁症、失眠障碍、偏头痛为主，临床研究亦证实其安全有效[11-13]。此外中药复方“异病同治”是通过多成分、多靶点、多通路而发挥作用，具有复杂网络的特质[14]，因此，运用网络药理学方法可一定程度揭示其作用机制。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分、靶点搜集与方剂-药物-成分-靶点网络构建 在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中检索柴胡疏肝散各药物有效成分及相关靶点，并限定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、血脑屏障(blood brain barrier，BBB)≥-0.3、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18进行筛选，将所得靶点在UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。然后再以方剂、药物、有效成分及相关靶点为节点，其相互关系为边通过CytoscapeV3.6.1构建网络。

1.2 疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集 在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/#)数据库中分别检索“depression disorder”“insomnia disorder”和“migraine”以搜集疾病靶点。再取药物有效成分靶点与各疾病靶点的交集，从而获得柴胡疏肝散有效成分中直接作用于3种疾病的靶点，并利用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制韦恩图。

1.3 疾病-方剂-有效成分-交集靶点网络和蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建 以疾病、方剂、有效成分以及所得3类交集靶点为节点，其相互关系为边，使用Cytoscape构建疾病-方剂-有效成分-交集靶点网络。再将3类交集靶点分别导入STRING数据库(https://string-db.org/)，限定物种为智人，并利用Cytoscape软件构建PPI网络，利用内置网络分析功能限定节点度值筛选PPI网络核心靶点。

1.4 基因本体(Gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 在Metascape(https://metascape.org/)数据库平台中导入3类交集靶点并分别进行GO生物过程、分子功能及细胞成分富集分析和KEGG通路富集分析，然后利用在线作图平台ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)绘制其富集气泡图。

1.5 核心成分和核心靶点分子对接 取疾病-方剂-有效成分-交集靶点网络中节点度大于2倍中位数的核心有效成分和PPI网络中节点度大于1.5倍中位数的核心靶点，利用PDB(http://www.rcsb.org/)及Zinc(http://zinc.docking.org/)数据库分别获得核心靶点和核心成分的3D结构，预处理后应用AutoDock vina分子对接，并在Pymol中可视化结果。

2 结 果

2.1 柴胡疏肝散有效成分、相关靶点搜集与方剂-药物-成分-靶点网络构建结果 通过检索TCMSP数据库及限定药物OB、BBB、DL筛选有效成分(见表1)，经去重排除后，共搜集到柴胡疏肝散 95种有效成分，138个关联靶点。其方剂-药物-成分-靶点网络构建如图1所示，该网络有241个节点、1 249条边，通过分析该网络，筛选节点度较大的有效成分和靶点，可见柴胡疏肝散中主要的有效成分为7-甲氧基-2-甲基异黄酮、芒柄花黄素、罗通定、β-谷甾醇、豆甾醇、川陈皮素等；主要靶点为PTGS2、ESR1、NOS2、AR、PPARG等。

表1 柴胡疏肝散主要有效成分基本信息

图1 方剂-药物-成分-靶点网络(CHSGS为柴胡疏肝散；CH为柴胡；CX为川芎；BS为白芍；ZQ为枳壳；CP为陈皮；GC为甘草；XF为香附)

2.2 疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集结果 在GeneCards、OMIM数据库中检索各疾病并将所得疾病靶点筛选、合并、去重、规范，得到抑郁症、失眠障碍和偏头痛靶点分别为4 777个、994个、1 748个。将柴胡疏肝散的138个靶点分别与其取交集(见图2)，得到柴胡疏肝散-抑郁症交集靶点113个，柴胡疏肝散-失眠障碍交集靶点43个，柴胡疏肝散-偏头痛交集靶点63个。

图2 药物-疾病交集靶点

2.3 疾病-方剂-成分-靶点网络和PPI网络构建结果 疾病-方剂-有效成分-交集靶点网络构建详见图3。图中包含213个节点、1 273条边。利用Cytoscape分析网络计算节点度，分别筛选出与各个疾病相关的节点度较大(DC>2倍中位数)的核心成分(见表2)。然后将3类交集靶点分别导入STRING数据库，选定物种为智人，得出以靶点为节点，蛋白互作关系为边的PPI网络(见图4)，其中柴胡疏肝散-抑郁症的PPI网络节点数为113个，边数为875条，平均节点度为15.5，平均局部聚类系数为0.543；柴胡疏肝散-失眠障碍的PPI网络节点数为43个，边数为196条，平均节点度为9.12，平均局部聚类系数为0.697；柴胡疏肝散-偏头痛的PPI网络节点数为63个，边数为341条，平均节点度为10.8，平均局部聚类系数为0.641，再通过Cytoscape分析3个PPI网络，分别筛选节点度大于1.5倍中位数的靶点为核心靶点，具体核心靶点详见表2。

图3 疾病-方剂-成分-靶点网络(CHSGS为柴胡疏肝散)

图4 柴胡疏肝散治疗抑郁症、失眠障碍、偏头痛的PPI核心靶点网络图(A为柴胡疏肝散治疗抑郁症的PPI网络；B为柴胡疏肝散治疗失眠障碍的PPI网络；C为柴胡疏肝散治疗偏头痛的PPI网络)

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析结果 将2.2中的3类交集靶点分别导入Metascape中进行GO和KEGG通路富集分析，其中柴胡疏肝散-抑郁症的GO富集分析共获得1 503条结果，其中生物过程1 255条，分子功能149条，细胞成分99条，另外KEGG通路富集分析得到148条结果。由结果可得，生物过程包括突触信号、对有毒物质的反应、细胞对激素刺激的反应、对铵离子的反应等；分子功能涉及神经递质受体活性、G蛋白偶联的胺受体活性、G蛋白偶联的乙酰胆碱受体活性等；细胞成分则包括突触后膜、多巴胺能突触、受体复合体等；涉及主要通路包括：神经活性配体-受体相互作用、胆碱能突触、多巴胺能突触、血清素能突触等。柴胡疏肝散-失眠障碍的GO富集分析共获得649条结果，其中生物过程518条，分子功能78条，细胞成分53条，而KEGG通路富集分析得到39条结果。从结果来看，生物过程包括化学突触传递、单胺运输、细胞对激素刺激的反应、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、对类固醇激素的反应等；分子功能涉及肾上腺素受体活性、激素结合、类固醇结合等；细胞成分则包括突触膜的组成部分、多巴胺能突触、受体复合体等；涉及主要通路则包括神经活性配体-受体相互作用、多巴胺能突触、胆碱能突触、雌激素信号通路等。柴胡疏肝散-偏头痛的GO富集分析共获得914条结果，其中生物过程741条，分子功能条108，细胞成分65条，此外KEGG通路富集分析得到82条结果。根据结果可得，生物过程包括：行为、突触信号、单胺运输、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、细胞对激素刺激的反应等；分子功能涉及肾上腺素受体活性、多巴胺结合、铵离子结合等；细胞成分则包括：突触后膜、膜筏等；涉及主要通路包括：神经活性配体-受体相互作用、可卡因成瘾、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路等。然后限定P<0.01，最小计数为3，富集因子>1.5筛选结果，绘制富集气泡图，详见图5～图8。再分别以疾病、交集靶点、通路为节点，其相互关系为边构建网络，以直观表明三者关联(见图9)，据该网络可知神经活性配体-受体相互作用通路极大可能是柴胡疏肝散治疗3种疾病过程中都最为关键的通路，因此，可认为柴胡疏肝散最可能藉由此通路对这些疾病产生作用，其通路的具体机制详见图10。

图5 柴胡疏肝散-抑郁症的GO富集分析气泡图

图6 柴胡疏肝散-失眠障碍的GO富集分析气泡图

图7 柴胡疏肝散-偏头痛的GO富集分析气泡图

图8 KEGG富集分析气泡图

图9 疾病-靶点-通路关系图

图10 神经活性配体-受体相互作用通路机制

2.5 核心成分与核心靶点分子对接结果 核心成分与核心靶点分子对接结果均<-20.92 kJ/mol，可见其核心成分与核心靶点的组合在预测中都可形成稳定结构(见表2)。然后取每种疾病中核心成分与核心靶点对接分数最小(分数越小表示结构越稳定)的组合运用Pymol对其构象可视化，其中绿色部分为靶点，黄色部分为成分分子，粉色标记残基，并显示其名称，黄色虚线为氢键，并标距离。详见图11。

表2 核心活性成分与核心靶点分子对接结果 单位：kJ/mol

图11 抑郁症、失眠障碍、偏头痛中对接最好的核心成分与核心靶点的分子对接构象

3 讨 论

3.1 中医理论 从“肝”论治 抑郁症、失眠障碍、偏头痛分别属于中医学的“郁证”“不寐”“头痛”范畴。《丹溪心法》记载：“气血冲和，万病不生，一有怫郁，诸病生焉。故人身诸病，多生于郁”[15]。说明疾病发生的物质基础是气血的运行不畅，而“气为血之帅”“气行则血行”，可进一步得出气的运行是疾病发生的最关键环节。另有“凡郁皆肝病也”之说，可见“肝”作为气机运行的枢纽，其功能异常则会导致“气郁”，从而发为各种疾病。加之现代人的生活压力较大，生活节奏较快，情志往往不遂。情志不舒，肝气郁滞，脏腑阴阳气血失调发为郁证；情志不畅，气机郁滞，营卫阴阳运行失常发为不寐；情志不调，气血郁遏，不通则痛则发为头痛。因此，这3种疾病总体而言都与“肝郁气滞”密切相关，柴胡疏肝散疏肝解郁、活血止痛，可对抑郁症、失眠障碍、偏头痛对证治疗。

3.2 构建网络筛选核心靶点与成分 综合分析本研究构建的方剂-药物-成分-靶点网络与疾病-方剂-有效成分-交集靶点网络得出的11种核心有效成分，其中成分A是具有多种功能的植物固醇，可激活细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)-环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)等途径而促进神经和突触形成[16]，并可通过减少氧化应激和炎症来保护大脑[17]，对于精神病症状，动物实验证实植物固醇可升高γ-氨基丁酸(GABA)、谷胱甘肽水平，降低多巴胺(DA)、丙二醛、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性[18]；成分罗通定是一种小檗碱，可作为肾上腺素能药物、抗精神病药物和多巴胺受体拮抗剂[19]；成分E是一种类黄酮物质，具有神经营养、保护作用，并且在动物模型中可发挥抗抑郁作用，此作用涉及血清素能、去甲肾上腺素能或多巴胺能系统的参与[20]；成分D是一种主要的植物甾醇，研究认为其有抗焦虑及镇静作用[21]，同时可抑制炎症反应而发挥神经保护作用[22]；光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定、甘草果苷、光甘草轮、美迪紫檀素、芒柄花黄素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮等成分都属于甘草中的黄酮类[23]，此类物质被报道有抗抑郁、神经保护等作用[24]。通过分析PPI网络得到柴胡疏肝散作用于3种疾病的24个核心靶点，其中MAPK1、MAPK8、MAPK14编码MAP激酶，MAPK1是一种已知的与抑郁、焦虑相关的信号分子[25]，MAPK8在成人新生颗粒细胞中的排他性抑制可缓解焦虑、抑郁[26]，MAPK14则已被证实可被柴胡疏肝散通过对其调节作用而发挥抗抑郁作用[27]；有动物实验证实小胶质细胞STAT3通过神经元巨噬细胞集落刺激因子介导的突触活动调节与抑郁相关的行为，表明抑制小胶质细胞STAT3可能是抑郁症的一种新的治疗策略[28]；SIRT1被认为是抑郁症的潜在基因靶标[29]；MMP已被证明在大脑的许多生理和病理过程中起着至关重要的作用，尤其是包括抑郁症在内的多种精神病[30]；ESR1、AR分别编码雌激素、雄激素受体，雌二醇水平的变化与认知、情绪调节和抑郁症易感性的变化有关，而雄激素水平低的男性使用雄激素替代疗法可改善抑郁症[31]，前列腺癌男性的雄激素剥夺疗法可导致抑郁症[32]；MAOA、MAOB、ADRA2C、ADRA2A、DRD2、HTR3A、SLC6A4、CHRNA4、ACHE、OPRM1所编码的蛋白包括肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、乙酰胆碱酯、mu阿片类受体、单胺氧化酶、5-羟色胺转运蛋白、乙酰胆碱酯酶，参与调控涉及肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、乙酰胆碱酯等的神经递质，而这些神经递质参与睡眠-觉醒的调控、抑郁症症状的调节以及偏头痛的发生[33-34]；PTGS2编码的环加氧酶可通过多种途径发挥神经保护作用[35]；CREB1编码的蛋白参与包括昼夜节律同步的多种细胞过程[36]，并与快速眼动(REM)睡眠在抑郁症中的作用有关[37]。

3.3 富集分析预测机制 由GO富集分析可以看出柴胡疏肝散治疗抑郁症、失眠障碍及偏头痛的主要生物过程、分子功能和细胞成分都与以上所述神经递质以及一些激素密切相关；而对于三者的通路则可以看出可能性最大的依然是神经活性配体-受体相互作用、胆碱能突触、多巴胺能突触、血清素能突触等诸如此类通路。从分子对接结果可得，所有核心成分均可能与核心靶点形成稳定结构，将其进一步进行数据分析，可得柴胡疏肝散治疗抑郁症对接较好的核心成分有豆甾醇、光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定等，对接较好的核心靶点有PTGS2、MMP9、DRD2、SIRT1等；柴胡疏肝散治疗失眠障碍对接较好的核心成分有β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黄素等，对接较好的核心靶点有MAOB、MAOA、DRD2等；柴胡疏肝散治疗偏头痛对接较好的核心成分有β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黄素等，对接较好的核心靶点有SLC6A4、DRA2A、DRD2等。可将这些成分和靶点视为柴胡疏肝散治疗这些脑病关键成分和关键靶点。

综上所述，根据中医理论以及网络药理学和分子对接的分析可以最终得出柴胡疏肝散治疗抑郁症、失眠障碍、偏头痛的可能关键成分为β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黄素、光甘草酮、4′-甲氧基光甘草定，可能关键靶点为PTGS2、MMP9、SIRT1、MAOB、MAOA、DRD2、SLC6A4、DRA2A，即最可能通过胺类神经递质发挥作用，其作用的主要通路则最可能是神经活性配体-受体相互作用、胆碱能突触、多巴胺能突触、血清素能突触等。此结论可为进一步研究和临床应用提供一定思路和参考。