基于网络药理学的菟丝子-女贞子药对改善卵泡质量低下作用机制研究*

陈翠 徐传花

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属医院常州市中医医院，江苏 常州 213003)

当代女性由于长期精神紧张、长期熬夜，会造成卵泡成熟障碍、卵泡质量低下、卵巢功能不全，严重者导致卵巢早衰，临床上往往表现为“不孕、月经不调”。中医理论上其多有“肾精不足”的病机，常以“补肾益精”为核心治疗原则。临床上，我的导师针对这种现象的治疗，一般多加以菟丝子-女贞子这一药对针对性处理，颇有成效。

网络药理学是一门基于“疾病-基因-靶点-药物”网络，以整体观的角度，通过揭示药物与疾病的内在联系，研究该药物能否指导疾病的治疗。某种程度上与中医整体观念的治疗原则不谋而合[1-2]。本研究借助中药复方网络药理学的方法，分析菟丝子-女贞子药对的主要活性成分及其改善卵泡质量低下的潜在靶点、信号通路，为日后研究这一药对或这一疾病提供相应的理论支撑。

1 材料与方法

1.1菟丝子-女贞子相关靶点筛选 使用TCMSP[3](https://www.tcmsp-e.com)找出2味中药化学组成成分，首先通过口服利用度(OB)≥30%及类药性(DL)≥ 0.18，对活性成分进行初步筛选，分别获得菟丝子、女贞子活性成分及其作用靶点。然后将筛选的结果导入到Uniprot蛋白质数据库[4](https://www.uniprot.org)，寻找其相对应的蛋白质名称。

1.2卵泡质量低下相关靶点筛选 在GeneCards数据库(https://www．genecards．org/)中，以“Poor follicle quality”为关键词搜索，来获得与卵泡质量低下相关的基因靶点，在该数据库中，我们通常依靠Score值的大小，来判断靶点与疾病的关系，通常Score值较高，则两者关系越密切。根据经验，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为卵泡质量低下的潜在靶点，若仍旧过多，再设定一次中位数，最终获得与卵泡质量低下相关的靶点，并导入UniProt数据库经名称-ID配对获得这些基因靶点的相应UniProt ID。

1.3菟丝子-女贞子药对活性成分-靶点网络的构建 使用软件Cytoscape 3.8.2来构建菟丝子-女贞子药对“活性成分-靶点”网络，使用Cytoscape 3.8.2中的Network Analyzer工具分析网络，然后再通过自由度(degree)由大到小排序，研究活性成分与靶点及其之间的关系，一般自由度越大，表明活性成分与靶点的关系越紧密。

1.4菟丝子-女贞子药对成分与卵泡质量低下靶点PPI网络构建 为明确菟丝子-女贞子药对活性成分靶点与卵泡质量低下靶点间的关系，使用Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图，获得菟丝子-女贞子药对活性成分靶点与卵泡质量低下靶点的交集基因，将韦恩图中获得的交集基因提交至STRING11.0[5]数据库(https://string-db.org)构建蛋白互作(PPI)网络模型，将生物种类设定为“Homo sapiens”，除隐藏游离节点，其余设置均为默认设置，构建PPI网络图，再将其导入到Cytoscape 3.7.2进行可视化展示，利用CytoScape 3.7.2中的Network Analyzer工具分析网络，再将其导出，然后通过自由度(degree)的降序排列，研究核心靶点，通常自由度越大，表明该靶点发挥的作用越大，即该靶点的重要性越高。

1.5菟丝子-女贞子药对成分与卵泡质量低下靶点功能与通路的富集分析 将菟丝子-女贞子药对改善卵泡质量低下的靶点提交至Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)平台，将种类设置为“human spanies”进行具体化分析，选用P<0.01差异性较明显的，进行GO分析，包括GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Celluar Components及KEGG分析，并将GO分析的富集结果导入微生信在线作图平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)中进行可视化展示。

1.6菟丝子-女贞子药对成分-卵泡质量低下靶点-通路网络图的构建 运用CytoScape3.8.2构建菟丝子-女贞子药对成分-卵泡质量低下靶点-通路网络图。

2 结果

2.1菟丝子-女贞子药对活性成分靶点的获取 初步提取菟丝子化学成分29种、女贞子化学成分119种，经OB、DL筛选后共获得菟丝子11种、女贞子8种活性成分，具体成分见表1。菟丝子成分作用靶点268个、女贞子成分作用靶点277个、合并后去重共得到靶点190个。

表1 菟丝子-女贞子药对活性成分

2.2卵泡质量低下相关靶点的获取 从Genecards数据库共获得卵泡质量低下靶点4984个。由于靶点较多，故按照上述方法首先计算出卵泡质量低下靶点Score的中位数为2.12，故设定Score大于2.12的靶点为卵泡质量低下的潜在靶点，筛选后得到2492个卵泡质量低下相关靶点，靶点仍较多，故再计算一次Score的中位数为3.80，最终得到1246个卵泡质量低下相关靶点。

2.3菟丝子-女贞子药对活性成分-靶点网络的构建 利用Cytoscape3.8.2对菟丝子-女贞子药对活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制和分析，共获得209个节点(包含190个靶点和16个活性成分)与564条关系，结果见图1。

Cytoscape网络分析示，槲皮素的自由度最大，山奈酚次之，β-谷甾醇、木犀草素、异鼠李素往后递减，推测槲皮素为改善卵泡质量低下的主要成分，见表2。

表2 菟丝子-女贞子药对主要活性成分网络节点特征参数

2.4菟丝子-女贞子药对成分-卵泡质量低下靶点PPI网络的构建 将筛选的菟丝子-女贞子药对活性成分靶点与卵泡质量低下靶点取交集，共获得菟丝子-女贞子药对活性成分靶点与卵泡质量低下靶点的交集基因107个，韦恩图见图2，进而将靶点提交至STRING11.0平台，隐藏游离节点1个，得到卵泡质量低下靶点PPI网络图，再将其导入到CytoScape3.7.2中展示，见图3。通过CytoScape 3.7.2中的Network Analyzer，根据自由度的大小得到核心靶点，具体见表3。

TP53在网络中的自由度最大，往后依次是AKT1、TNF、IL-6、JUN、VEGFA、CASP3、ESR1，故推测TP53为菟丝子-女贞子药对改善卵泡质量低下的最主要靶点，AKT1、TNF、IL-6、JUN、VEGFA、CASP3、ESR1为相对重要的靶点，见表3。

2.5靶点功能与通路的富集分析 借助微生信作图对Metascape数据库对菟丝子-女贞子改善卵泡质量低下相关靶点信号通路分析的GO的BP、CC、MF结果可视化，见图4。再将KEGG通路结果使用微生信绘制气泡图，见图5。由结果可见卵泡质量低下主要参与的生物学过程包括Bcl-2 family protein complex( Bcl-2 家族蛋白复合物)、response to oxidative stress(对氧化应激的反应)、transcription coactivator binding(转录辅激活因子结合)、steroid hormone receptor activity(类固醇激素受体活性)、positive regulation of cell motility(细胞运动的正调控)、RNA polymerase II general transcription initiation factor binding(RNA聚合酶II一般转录起始因子结合)见图 4，参与的通路主要Pathways in cancer(癌症中的通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt信号通路)HIF-1信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等，见表4。

表3 菟丝子-女贞子药对主要活性成分靶点网络节点特征参数

2.6菟丝子-女贞子药对核心成分-卵泡质量低下靶点-通路网络图的构建 运用CytoScape3.8.2构建菟丝子-女贞子药对-卵泡质量低下靶点-通路网络，见图6。菟丝子-女贞子改善卵泡质量低下靶点通路KEGG通路结果见表4。一般来说，Count(富集数量)越大，代表该通路与该现象关系越密切。

表4 菟丝子-女贞子改善卵泡质量低下靶点通路富集结果

3 讨论

卵泡质量低下可归属于“不孕”范畴，属于不孕众多因素中的一种，其主要病机主要源于肾精不足，“肾主藏精”，主要体现在肾主生长发育与生殖，而肾主生殖主要表现在化生天癸，促进和维持生殖机能。天癸是肾精充盈到一定程度上产生的，天癸至，女子按期排卵，月经来潮。菟丝子、女贞子分别为五子衍宗丸、二至丸的君药，而五子衍宗丸[6]、二至丸又分别是补肾益精、补益肝肾的经典名方。相关实验[7-10]发现，五子衍宗丸加减通过改善性激素水平，从而能够提高肾虚精亏型、排卵障碍型不孕患者的受孕率及改善卵巢功能不全；在张明敏[11]的研究中，其归纳总结了黄光英教授治疗早发性卵巢功能不全的用药心得：运用菟丝子、女贞子、枸杞子等药来滋肾补肾、滋养肝肾、健脾补肾、补肾活血。有研究[12-13]直接表示菟丝子具有类雌激素样的特点，促卵泡发育。相关药理显示：菟丝子的核心成分可用于女性生育、体质量失调、炎症、坏疽、肝损伤等相关疾病的治疗[14]，女贞子则具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗骨质疏松、降血糖、调血脂、免疫调节以及保肝作用等相关药理活性[15-16]。故该药对很大程度上具有补肾益精、调和肾中阴阳的作用。目前，对于菟丝子-女贞子药对的研究较少，故本研究将对菟丝子-女贞子药对改善卵泡质量低下作深入研究。

3.1药物活性成分分析 由图1及表1、2所示，菟丝子-女贞子药对在改善卵泡质量低下中发挥主要作用的成分是槲皮素(Quercetin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、异鼠李素(isorhamnetin)等。表明这些化合物在改善卵泡质量低下方面起着主要作用，其中槲皮素、山奈酚、及β-谷甾醇为菟丝子-女贞子药对所共有的成分。相关研究也进一步证实了其在改善卵泡质量低下中发挥的作用，如黄长盛等[17]的实验中示：槲皮素组较之模型组，血清中E2、AMH含量增加，同时，槲皮素同样能促进各级卵泡发育，促进颗粒细胞增殖，增加颗粒细胞的雌激素分泌，进而改善卵泡质量低下。在马纳等[18]的研究中示：槲皮素可以抑制排卵过程中产生的卵母细胞质量下降，并改善后续的胚胎发育。山奈酚是一种膳食类黄酮，具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡、抗癌、雌激素和抗雌激素活性[19-21]，因其类雌激素活性，故可促进卵泡发育，从而改善卵泡质量低下。具体研究[22-24]表明：β-谷甾醇在促进卵巢颗粒细胞分泌雌二醇(E2)的效果较明显，而在我们的下丘脑-垂体-卵巢调节轴上，雌激素与卵泡相辅相成，排卵前，雌激素的足量分泌，可直接正反馈调节促性腺激素的分泌，促卵泡发育、成熟。但其余化合物的具体作用于卵泡质量低下的药理仍需进一步研究。

3.2关键靶点结果分析 本研究经筛选后共得出190个潜在关键靶点。根据degree值排名，其中较为重要的是TP53(肿瘤蛋白P53)、AKT1(蛋白激酶1)、TNF(肿瘤坏死因子)、IL-6(白介素-6)等。研究表明，TP53是凋亡相关的因子，其主要是通过刺激BAX和FAS抗原表达或通过抑制Bcl-2表达调控细胞周期，从而介导细胞凋亡。TP53被证实其与生殖有一定的影响，相关研究[25-26]提示：其参与卵泡颗粒细胞的凋亡，进而影响卵泡质量。AKT是一种蛋白激酶，它在整个信号通路上起着关键性的作用，活化的AKT参与各种细胞功能的调节如：细胞增殖、凋亡和转移。AKT1存在于卵母细胞中，能够促进卵泡的生长、发育、成熟以及参与卵泡颗粒细胞的增殖；若AKT1异常，则卵泡发育受阻，进而导致卵泡质量低下[27-30]。TNF也是细胞凋亡相关因子，其已被证实[31-35]能够通过抑制颗粒细胞分泌的E2和P(孕酮)的量，加速卵母细胞或卵泡的凋亡进程，进而影响卵泡的质量。在吕淑兰等[36]的实验中，通过监测IL-6在整个月经周期中的水平，结果示排卵期达高峰，可以推断其与促性腺激素的作用类似，从而得出IL-6可以促进卵泡发育的结论。

3.3通路与生物进程分析 本研究富集结果显示，菟丝子-女贞子药对改善卵泡质量低下主要涉及以下几个通路：P13K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等。其中PI3K-AKT通路中分子与卵泡的生长、发育、成熟与颗粒细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，是细胞增殖和凋亡最主要的信号传导通路之一。故在人类的卵母细胞中，PI3K通路中各信号分子表达异常，则会影响卵泡的生长发育，导致其发育缺陷或畸形[27-30]。HIF是一种高度保守的转录因子，其中卵巢颗粒细胞已被证实[37]可以经HIF1介导VEGF促进卵泡发育、黄体形成。TNF通路可以介导颗粒细胞的凋亡以及卵泡闭锁。MAPK信号通路主要是介导细胞凋亡，研究发现[38-39]其也参与到卵泡的生长、发育过程中。

4 结语

综上所述，菟丝子-女贞子改善卵泡质量低下的主要成分可能是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等，涉及到的关键通路主要有P13K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等，参与Bcl-2家族蛋白复合物、对氧化应激的反应、转录辅激活因子结合、类固醇激素受体活性、细胞运动的正调控等多个生物学工程。本研究对菟丝子-女贞子药对的潜在治疗作用进行了初步探讨，对于应用于临床提供了初步的循证证据，仍需进一步的实验研究进行佐证。存在的不足是：①菟丝子-女贞子药对在煎煮时会发生复杂的化学反应。②数据库的信息可能存在更新不足的情况，故未来将继续关注此领域的相关进展，便于进行相关补充。③网络药理学仍然需要发展，我们不能简单地对化学成分进行求和，需要在“分子结构”的网络药理学上，研究出基于“药材”的网络药理学，即协同作用的网络药理学[40]。