遗传性胆红素代谢障碍与胆汁淤积NGS方法的建立及应用

宋燚， 贾思雨， 武丽娜， 张伟， 欧晓娟， 黄坚*

1.首都医科大学附属北京友谊医院临床医学研究所，北京 100050；

2.北京大学人民医院麻醉科，北京 100044；

3.首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心，北京 100050

先天性胆红素代谢障碍性肝病是指胆红素生成过多，或肝细胞对胆红素摄取、运输、酯化及排泄等环节发生障碍［1］，导致血中胆红素浓度增高，扩散进入组织、大部分内脏器官和某些体液使其黄染而表现为黄疸，主要包括Dubin-Johnson综合征（DJS）、Rotor综合征、Gilbert综合征和Crigler-Najjar综合征［2-4］。由于发病率较低或诊断不明确，常见个案报道。遗传性肝内胆汁淤积症是儿童期肝病的重要病因，表现为皮肤黄染、尿色加深、便色浅等，逐渐发展为高胆红素血症，如诊治不及时会严重影响患儿生长发育，甚至导致死亡［5-6］。胆汁淤积症包括家族性肝内胆汁淤积症Ⅰ～Ⅲ型（BRIC/PFICⅠ、BRIC/PFICⅡ、BRIC/PFICⅢ）、Alagille综合征、缺陷病以及各种胆汁酸合成缺陷等［7-9］。由于发病率低、临床表现不典型，且常规检查无特异性等导致临床诊断困难。

上述几种病症就单一病种而言，发病率并不高，但总体发病率却不容忽视。同时上述代谢性肝病的临床表现缺乏特异性，可与获得性肝损伤重叠，如病毒性肝炎、酒精性肝损伤等，使临床诊断较为困难，容易造成漏诊和误诊［10］。因此建立快速准确的检测技术对我国先天性胆汁淤积与胆红素代谢障碍的识别诊断具有重要意义［11-12］。基因检测是目前诊断代谢性肝病的“金标准”，但是人群遗传异质性和个体差异导致基因检测需要覆盖致病基因的所有外显子及内含子剪接区，才能准确无遗漏的识别其致病突变，众多的基因和复杂的致病机制使分子生物学检测诊断具有较高挑战性［13-14］。目前最常采用的Sanger测序技术只能用于单个遗传代谢肝病的检测，同时只能检测某几个热点突变，并可能出现假阴性，而且需要逐个基因逐个位点的检测，操作耗时耗力，较为繁琐。而全外显子测序价格昂贵，对于少数单基因病的检测较为浪费。

因此，本研究基于高通量测序技术建立并验证了针对我国人群常见的遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征目标基因的探针捕获检测技术平台，既覆盖了所选基因的所有靶区域，又避免了应用全外显子测序导致的高昂费用［14］。利用该技术对北京友谊医院胆红素代谢障碍和胆汁淤积症患者进行了基因检测，以期为患者及家庭提供基因诊断的依据，并为该类疾病的早期诊断提供经验和方法。

1 材料和方法

1.1 样本采集

收集2016年8月至2020年12月在首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心诊断为胆汁淤积和先天性胆红素代谢障碍患者样本39例，其中Gilbert综合症患者13例、Dubin-Johnson综合征患者13例、BRIC患者7例、Alagille患者3例、Rotor综合征患者3例，无α1抗胰蛋白酶缺乏症和Citrin患者，取患者外周血2～3 mL。本研究已通过医院医学伦理委员会批准（审批号：2019-P2-217-02），患者均签署书面知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 探针的设计 选择胆汁淤积BRIC/PFIC常见3个基因ATP8B1、ABCB11和ABCB4，Alagille致病基因JAG1，Citrin致病基因SLC25A13，胆红素代谢障碍Dubin-Johnson致病基因ABCC2，Rotor综合症致病基因SLCO1B1和SLCO1B3，Gilbert及Crigler致病基因UGT1A1，α1抗胰蛋白酶缺乏症致病基因SERPINA1，共10个基因覆盖117个外显子，如表1所示。提取患者外周血样基因组DNA，进行10个基因的试剂盒检测。利用安捷伦的eArray免费在线设计平台（http：//earray.chem.agilent.com/eArray），设计了1 084个平均长度为120 bp捕获探针（bait），委托北京艾吉泰康生物科技北京有限公司合成。

表1 检测的基因及区域Table 1 The target genes and their regions

1.2.2 样本文库的制备 选择6例已经过Sanger测序、有明确变异位点的DJS患者样本，其基因组DNA用Bioruptor Pico超声仪进行DNA片段化。采用Bioruptor Pico超声仪设定程序：开启冷循环使水温降至4℃，设置参数ON 30 s，OFF 30 s为1个循环，每10个循环为一轮，共进行3轮。超声完成后取DNA 1 µL，使用Agilent 2100（DNA 1000 Assay）进行检测，DNA主峰约为150～200 bp。然后进行末端修复，体系为：35µL片段化后的DNA，5 µL dNTPs，10 µL 5×ERA-Tailing Enzyme。Mix PCR程序：热盖温度85℃；20℃ 30 min；65℃30 min。反应结束后连接P1和P2接头，体系为：15 µmol·L-1接头 5 µL，DNA连接酶10 µL，5×Ligation Buffer 20µL，加水至总体积100µL。吹打混匀后运行PCR程序20℃15 min。然后在不同样本的P1或P2端连接不同的index序列，体系为：PCR Master Mix 25µL，P1端index引物2.5µL，P2端index引物2.5µL。吹打混匀后进行PCR，程序为：98 ℃ 2 min；98 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72℃，30 s共7个循环；72℃1 min。纯化完成后取1µL样品分别使用 Qubit® 3.0 Fluorometer（Qubit dsDNA HS Assay Kit）进行文库浓度测定和Agilent 2100 Bio-analyzer system（Agilent DNA 1000 Kit）进行片段长度测定。

1.2.3 样本富集杂交 取上述文库750 ng进行靶序列探针捕获，将文库浓缩后加入杂交反应体系，体系为：杂交缓冲液13µL，接头5µL，接头通用封阻序列2µL，RNAse Block 5µL，无菌水3µL，捕获探针2µL，运行PCR程序：热盖温度85℃，80℃5 min，50 ℃ 过夜16～24 h。利用Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠（Invitrogen公司）进行靶序列富集并配制体系：产物24µL，接头引物50µmol·L-11µL，缓冲液25µL。运行PCR程序：95℃预变性1 min；98℃变性20 s，60℃复性30 s，70℃延伸30 s，12个循环；70℃再延伸5 min，反应结束后使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化产物。

1.2.4 测序上样前质量控制及测序后数据分析上样前对文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，浓度约在 1～10 ng·µL-1；并使用 Agilent DNA 1000 Kit进行片段长度测定，文库长度约在270～320 bp之间。利用NextSeq 500测序平台测序。测序完成后对获得的数据Raw data进行初步过滤，得到Clean data。采用BWA软件将Clean data与参考基因组hg19做比对，得到bam结果文件。基于与基因组参考序列比对的bam结果，采用GATK软件寻找SNP和InDel，然后运用ANNOVAR软件对SNP、InDel位点进行注释，确定突变位点对应的基因信息、功能信息和有害性等。与Sanger测序结果相比，评价本方法的准确性。

1.2.5 统计学处理 将39例样本的测序结果按照1.2.4进行注释，注释后的临床样本测序数据通过HGMD、ClinVar和OMIM数据库对致病突变进行筛选，未报道的新致病突变通过与千人基因组10 450个样本的数据集进行比较，进行哈代-温伯格（在理想状态下，各等位基因的频率和基因型频率在遗传中稳定不变）检验，算出哈温平衡P值（HWE_P值），HWE_P＞0.05的突变列为哈温平衡可信位点。再对两组数据进行χ2检验，计算P值，P＜0.05为组内差异有统计学意义。

2 结果和分析

2.1 基因组DNA的片段化

将6例已测序DJS患者的基因组DNA断裂片段集中于250 bp（图1A）。完成切口平移和纯化后的DNA片段与合成的探针液相孵育杂交24 h，经捕获磁柱富集靶标片段后进行PCR扩增建立文库，使用Agilent DNA 1000试剂盒进行片段长度测定，约在270～320 bp间（图1B）。即基因组DNA均匀打断后，通过设计的探针将靶标序列精准捕获并富集，构建的文库符合测序上样的浓度和片段长度。

图1 6例DJS样本片段化基因组DNA安捷伦2100检测图Fig.1 Fragment genomic DNA of six DJS samples using Agilent 2100

2.2 测序结果质控评价

测序数据的质量主要分布在Q30≥80%以上，保证后续分析的正常进行。根据测序技术的特点，测序片段末端的碱基质量一般会比前端的低。本方法的平均Q30达到96.07%（图2），完全符合分析要求。测序深度均一化处理后均一性更高，在平均深度周围成泊松分布。本方法均一化程度高，测序偏好性低且测序深度高（图3）。高通量测序质控数据见表2，完全符合结果分析和判定要求。与6个已Sanger测序、有明确变异位点的样本比较，本检测方法检出变异位点的位置和基因型的符合率和准确性为100%。

表2 高通量测序质控数据统计Table 2 Statistics of quality control data of next-generation sequencing

图2 样本D1碱基质量值分布图Fig.2 Distribution of base mass values of sample D1

图3 样本D1测序深度分布图Fig.3 Distribution map of sequencing depth of sample D1

2.3 临床样本测序结果

入组的胆红素代谢障碍和胆汁淤积患者39例中发现的已报道突变位点39个（表3），新型突变19个，在千人基因组对照数据库（n=14 050）中均未出现（表4）：其中BRIC和PFIC I对应基因ATP8B1中已报道突变位点4个，新型突变1个；PFICⅢⅡ对应基因ABCB11中已报道突变5个，新突变2个；PFICⅢ对应基因ABCB4中已报道突变3个，新突变2个；Gilbert和Crigler-Najjar综合症对应基因UGT1A1中已报道突变5个，新突变3个；Alagille综合征对应基因JAG1中已报道突变2个；Dubin-Johnson综合征对应基因ABCC2中已报道突变4个，新突变7个；Rotor综合征对应基因SLCO1B1和SLCO1B3中已报道突变分别为5个和6个，新突变均为1个；α1-抗胰蛋白酶缺乏症对应基因SERPINA1已报道突变4个；Citrin缺乏症对应基因SLC25A13已报道突变1个，新突变2个。新型突变19个在39个样本中均只出现1次，其哈温平衡检验结果均为P=0.768＞0.05，符合哈文平衡可信位点，χ2检验，组内差异有统计学意义（P=0.042 7＜0.05）。

表3 39例遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征患者已报道突变Table 3 Mutations have been reported in 39 patients with abnormal bilirubin metabolism and cholestasis

表4 39例遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征患者新突变Table 4 The new mutations in 39 patients with abnormal bilirubin metabolism and cholestasis

3 讨论

遗传性胆红素代谢异常及肝内胆汁淤积症是指因基因突变引起的肝脏代谢障碍性疾病，具有先天性、终身性和家族性的特征。胆红素代谢是指肝细胞将非结合胆红素转变为结合胆红素，以维持血中胆红素的正常浓度，肝脏对胆红素的处理包括摄取、结合和排泄3个步骤。胆汁淤积的病因复杂，主要包括代谢或内分泌疾病、肝外胆道疾病、肝内疾病、解剖异常、感染、中毒、遗传等［15］。由于遗传性胆红素代谢异常及肝内胆汁淤积综合征发病率低，发病后呈现进行性加重，如未能早识别、早干预、早治疗，可能会导致残疾或死亡。但其早期临床症状及实验室检查常无特异性指征，病因往往无法确认，常会出现漏诊或误诊，极大阻碍了鉴别诊断［16］。目前，遗传性胆红素代谢异常及胆汁淤积综合征的诊断方法主要有针对酶活性或代谢物的生化测定、气相色谱-质谱联用技术、串联质谱联用技术，以及针对基因的检测方法如定量PCR、一代测序等［17］。这些技术和方法最大的局限性在于普遍通量低，一般一次只能检测一种疾病，无法满足遗传代谢性肝病可检出病种逐年增多的现状；同时酶活性或代谢物的检测结果存在结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多等问题。因此，开展遗传性胆红素代谢异常及肝内胆汁淤综合征的早期高通量筛查检测是防治的关键。本研究建立了基于高通量测序的用于检测遗传性胆红素代谢异常及胆汁淤积综合征相关基因变异的探针组、方法和试剂盒，并进行了临床样本的验证和应用。该方法覆盖了10个基因的117个外显子区及剪切区，可同时检测11种遗传代谢性肝病易感基因的全部外显子及内含子剪切区的单核苷酸多态性和/或拷贝数变异，该方法检测通量高、耗时短、结果准确可靠，与Sanger测序法逐个基因逐个片段检测相比，大大节约了所用的时间成本和人力成本［14，18］。

利用本方法对首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心收集的胆红素代谢异常及胆汁淤积综合征39例患者进行检测，平均测序深度为548×，杂合突变频率落在34.3%～61.2%之间，纯合突变频率落在99.6%～100%之间，完全符合结果判定要求。测序后的结果进行生物信息学分析，通过HGMD、ClinVar和OMIM突变数据库对新发突变进行筛选，未报道的新突变通过与千人基因组数据集对比，在患者组中发现了现有数据库没有收录的新型突变，包括移码突变、错义突变、剪接突变、翻译提前终止和非移码插入，展示了高通量靶向捕获测序在遗传性胆红素代谢异常及胆汁淤积综合征研究中的重要作用。所有新型突变都经过哈温平衡检验和χ2检验，符合哈温平衡的可信位点，且组内差异有统计学意义［19-20］。

由本研究结果可以看出，39例患者样本共检测到58种突变，新型突变19种。先天性胆红素代谢异常患者29例。其中Gilbert综合症患者13例，Gilbert是由于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）活力明显下降，引起血清非结合型胆红素水平升高，UGT1A1基因启动子的突变是Gilbert综合征的主要分子遗传学基础。Crigler-Najjar综合征为先天性肝细胞对胆红素结合功能障碍性疾病，患者的先天性非溶血性黄疽是由于UGT1A1活性严重或部分缺乏所致，本次共检测出8种UGT1A1基因突变。Dubin-Johnson综合征患者13例，患者由于肝细胞排泌结合胆红素先天性障碍出现结合高胆红素血症，其致病基因ABCC2本次共检测出11种突变。Rotor综合征患者3例，患者由于肝细胞摄取非结合胆红素和排泌结合胆红素障碍导致遗传性高胆红素血症，基因SLCO1B1和SLCO1B3同时致病突变才有可能发病，共检测突变位点13个。胆汁淤积症患者10例，其中家族性肝内胆汁淤积症1～3型（BRIC/PFICⅠ、Ⅱ、Ⅲ）7例，共检出17种突变；Alagille患者3例，共检出2种突变。综上所述，本研究建立的高通量靶向测序方法检测到了不同类型的突变，有效地揭示了包含致病性突变和遗传易感性突变在内的遗传多样性。我们在后期研究中将通过增加探针数和扩大检测范围为遗传代谢性肝病患者及家庭提供早期精准的基因诊断。