导电材料在神经组织修复中的作用机制与应用进展

王煜煜，王善龙，宋功吉，俞杨销，王建南，许建梅

(苏州大学，a. 纺织与服装工程学院；b.纺织行业医疗健康用蚕丝制品重点实验室，江苏苏州 215027)

在日常生产生活中，由于意外事故、疾病及各种创伤事件等导致的周围神经损伤是一种临床上常见的慢性创伤，会导致患者生活质量下降并造成一定的经济负担。周围神经的短缺损可以通过简单的外科缝合进行自我再生，而对于缺损距离超过直径3或4倍的长缺损，就需要其他的辅助治疗手段[1]。目前，周围神经损伤的标准治疗方法是自体神经移植，但面临供体部位的发病率、神经瘤形成的可能性、直径不匹配以及手术时间的延长等问题；异体神经移植则存在免疫和排斥反应[2]。因此，对于周围神经损伤的修复治疗一直是当前研究的热点和难点，为了克服神经移植的种种限制，使用人工神经导管(NGC)成为一种非常有前途的选择。

理想的NGC需要提供一个生物活性环境以促进髓鞘形成，给予轴突生长和再生轴突结构支持。目前，市售NGC主要由胶原蛋白(Col)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、壳聚糖(CTS)、聚乙烯醇(PGA)或猪小肠黏膜下层制成，用于修复小于 3 cm 的神经损伤[3]。NGC为神经细胞迁移、粘附、增殖提供了有效的仿生支架，为了提高神经再生的效果还需要其他生物分子如神经生长因子或物理信号如电刺激来刺激细胞再生修复受损的组织[4]。导电材料以其固有的电特性，在促进周围神经损伤再生方面有很大的应用潜力。基于导电材料的重要作用，本文将讨论电刺激促进神经再生的机制，分析聚吡咯(PPy)、聚苯胺(PANi)、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)、石墨烯(GO)及其衍生物、碳纳米管(CNT)等几种导电材料的性能、特点、在神经修复中的作用与应用，总结导电性NGC的制备方法及特点，指出未来导电材料在神经修复中应用时重点考虑的一些关键问题：比如通过改性、控制聚合条件等方法改善导电材料难加工力学性能差的缺点，导电材料在机体内长期使用的代谢机制与生理毒性问题。

1 周围神经再生

神经系统的基本结构和功能单位是神经元，其轴突由神经纤维细胞、雪旺细胞(SCs)支持，这些细胞可以是无髓鞘的或有髓鞘的。髓鞘由髓鞘和形成SCs细胞膜的蛋白质组成，反复缠绕在轴突周围，充当绝缘体并加速神经信号传输[5]。周围神经创伤性损伤后，损伤的神经发生一系列病理和生理事件，导致远端残端的Wallerian变性和近端残端小区域内的轴突变性[4]，同时神经的自我修复机制也会被触发。电刺激可以加强这一修复机制，同时用于修复缺损神经的导管若具有一定的导电性可以提升电刺激作用。

1.1 神经的再生修复机制

周围神经损伤后神经元的再生过程如图1所示[5]。神经损伤后，巨噬细胞和单核细胞迁移到受损神经残端以去除由此产生的髓鞘和轴突碎片，而SCs增殖形成Büngner带，同时产生的神经生长因子如胶质源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、神经调节蛋白(NRG1)和细胞外基质(ECM)能够刺激轴突再生。轴突再生从近端残端开始，一直持续到远端残端。新的轴突芽从Ranvier节点发出，并通过SCs进行髓鞘再生，再生轴突延伸直至达到其突触目标以实现功能再支配[4]。仿照这种结构制成的NGC已经有望代替自体神经移植，以治疗较大间隙的神经损伤。

图1 周围神经损伤后神经元再生Fig.1 Neuronal regeneration after peripheral nerve injury

1.2 电刺激促进神经再生

由于细胞膜的结构，细胞具有电特性，例如电阻和电导率，其中细胞内部为电负性，外部为电正性。当没有神经透射时，静息膜电位约为-70 mV。动作电位是静息电位的意外变化，随后快速去极化和复极化，从而导致电活动[6]。信息就是通过一系列动作电位在神经元中沿着轴突传递，因此，神经元受到外源性电刺激强烈影响[7]。电刺激已被证实是一种能在体内和体外引导干细胞向电活性细胞迁移、增殖和分化的有效方法，适当的刺激方式可以引导细胞再生[8]。

研究表明在神经缺损间建立电场环境时，短暂(1 h)低频(20 Hz)的电刺激可加速轴突再生，促进功能恢复[9-10]。虽然电刺激促进神经元生长的潜在机制尚不完全清楚，但存在几种不同的观点：

a)电刺激调节细胞活动。电刺激已被证实可调节细胞活动，如细胞粘附、增殖、迁移以及蛋白质生成，因此猜测电刺激通过刺激各种细胞通路，导致细胞骨架改变和细胞器重新分布，从而引导近端神经残端再生[11]。

b)电刺激促进神经营养因子 (NGF) 的表达。周围神经损伤后，由于来自远端SCs所提供的GDNF、脑源性神经营养因子(BDNF)等营养因子表达较慢且难以在早期对轴突再生提供有效支持。神经损伤后，低频电刺激能促进上述物质的早期表达。这些早期表达的营养因子一方面能够诱导较多的神经元维持再生状态，提高神经元再生率，另一方面，促使这些具有再生功能的神经元在神经损伤后尽早启动轴突再生过程，并帮助再生的轴突尽快通过再生难度较大的损伤点[12]。

c)电刺激提高细胞内复合肌肉动作电位(cAMP)水平。增加cAMP水平或使用其抑制剂都会影响神经元的生长和轴突的伸长，电刺激通过增加神经元内cAMP促进轴突生长[12]。

1.3 导电基材上的神经再生

神经元在生长过程中会延长轴突使其与目标接触，随着连接的建立，发育轴突伸长能力下降，发生创伤事件后必须使神经元恢复到发育阶段的“伸长模式”。Ca2+流入轴浆是损伤引起的第一个信号之一，钙/钠通量倒置引发的去极化沿轴突传播到细胞体，细胞内Ca2+浓度的变化会引发轴突生长所需的各种细胞自主机制来调节再生[13]。Mcgregor等[14]提出电刺激可以模仿在轴突损伤后逆行的钙波，以引发再生的细胞自治机制。用导电材料进行电刺激可显著促进神经突生长和神经再生。除此之外，神经修复的实际应用也高度依赖于神经细胞的功能和对底物电导率的反应[15]。

已有研究表明神经干细胞能够在具有良好铺展形态的支架上生长，通过电刺激，显著促进了神经干细胞的增殖和分化[16]。Pires等[17]评估了在有无电刺激的情况下，导电基材上神经干细胞的分化情况。事实证明，导电基材能够调节细胞表面受体的排列和蛋白质的吸附，促进细胞骨架重组，引起细胞形态的变化；在电刺激下获得的神经元的数量增加，并且呈现出更高的伸长率和更长的突起。更重要的是，即使没有外源遗传物质或化学刺激物干扰基因组，导电基材也会增加干细胞向神经细胞的分化，这与其导电性直接相关[6]。导电NGC与电刺激协同作用促进神经再生也受到越来越多关注。

2 导电材料

为了制备具有导电性的NGC，常采用一些导电材料如聚吡咯、聚苯胺、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)、石墨烯、还原氧化石墨烯(rGO)、碳纳米纤维(CNF)等通过涂层、溶液混合成形等方法制备导电NGC。表1 从制备材料、制备方法、导管参数、体内外试验结果等多个方面总结了相关的研究。表1中SFI是指坐骨神经指数，它是通过对大鼠步行轨迹分析经过计算得到的，正常大鼠坐骨神经的SFI等于0，而完全切断坐骨神经的大鼠SFI等于-100。从表1可以看出导电材料大多与一些天然材料或合成材料结合制成复合型的导电NGC。天然材料包括丝素蛋白(SF)、壳聚糖(Cs)、柞蚕丝素蛋白(ApF)、明胶(Gel)等；合成材料包括聚丙交酯-聚乙二醇共聚物(PELA)、聚己内酯(PCL)、聚L-丙交酯-己内酯(PLCL)、聚D,L-丙交酯(PDLLA)、聚L-乳酸(PLLA)等。导电材料与上述材料结合制成的导电NGC具有良好的生物相容性、机械加工性和导电性。体内外研究表明，这些导电材料支持多种细胞的粘附、增殖和分化，在动物实验中导电NGC也被证实有效促进了神经再生。但目前的研究还有许多问题需要解决。首先，新型生物材料在体内长期安全性没有研究；其次，导电材料在体内的代谢机制问题没有涉及；最后，对长距离神经损伤的治疗仍然是一个挑战。

表1 基于导电材料的人工神经导管Tab.1 Artificial nerveconduits based on conductive materials

2.1 导电聚合物

2.1.1 聚吡咯(PPy)

聚吡咯是一种共轭聚合物，可以通过化学或电化学手段合成，具有良好的生物相容性，长时间植入体内对机体不会产生明显的过敏、炎症及损伤[30]。但PPy分子骨架高度共轭使其非常坚硬，不溶且加工性较差。为了优化PPy在生物医学尤其是组织工程应用中的电导率优势，必须将其转变为可加工的形式[31]。

早在1994年，Williams等[32]研究就表明PPy具有良好的生物相容性，并肯定其作为NGC的潜力。Wang等[33]将PPy通过电化学法涂在硅胶管的内表面来制备NGC。研究表明，PPy浸提液没有急性和亚急性毒性，热原、溶血、过敏原或诱变的证据；在PPy包膜的硅胶管上SCs的迁移和背根神经节的轴突生长优于对照组。PPy制成导管后与电刺激联合使用似乎能促进神经再生和功能恢复，为修复长节段神经缺损提供了一条很有前途的途径。Zhou等[19]通过静电纺丝技术制备了PPy/PELA导电复合支架，并将其应用于周围神经缺损的修复。图2显示了支架的SEM显微和实物照片以及PPy/PELA导电复合支架通过自发电刺激促进大鼠周围神经再生的过程。体外实验结果表明，制备的材料具有良好的生物相容性，支持PC-12细胞的附着和增殖。此外，植入大鼠坐骨神经缺损处12周后，与自体移植物效果相似。

图2 静电纺丝PPy/PELA纤维导管及其在体植入神经再生的方法Fig.2 Electrospun PPy/PELA fibrous conduits and the procedures of the in vivo implantation for nerve regeneration

2.1.2 聚苯胺(PANi)

聚苯胺是苯胺在酸性条件下的氧化聚合产物，通常称为苯胺黑。根据氧化程度，PANi可以以各种绝缘形式存在，例如完全还原的无色醛亚胺碱、半氧化的绿醛亚胺碱和完全氧化的过氧化氢亚胺碱。完全氧化态是PANi最稳定和研究最广泛的形式[34]。在神经组织工程中，PANi是有潜力的材料，可与其他可降解聚合物结合，在较低的电刺激下促进轴突生长。Wang等[21]将PANi逐层沉积到玉米醇溶蛋白支架表面，制备NGC。植入早期(2个月)导电NGC有效改善神经功能恢复，但植入后期(4个月)NGC降解产生的碎屑引起空间位阻，引起炎症反应和细胞毒性，妨碍神经再生。PANi完全不溶于水，在水介质中稳定，几乎无毒。细胞毒性产生的原因似乎与其低分子量组分有关。他们有两种类型:a)反应副产物和基于苯胺的低聚物(如苯胺三聚体);b)构成PANi的酸[35]。因此，与PPy等生物相容性好的导电聚合物相比，PANi在生物医学领域应用仍受到限制。

苯基/苯基封端的四聚体和八聚体等苯胺的一些低聚物在结构上与PANi相似，结构稳定，细胞毒性小，表现出更好的溶解性和可加工性，吸引了研究人员的关注[36]。Guo等[22]将苯胺五聚体和聚己内酯通过溶液浇铸和盐浸法制成电活性可降解多孔导管，证明了导管无细胞毒性是神经组织工程良好候选者。此外，Das将低聚苯胺分子与丝素蛋白溶于甲酸，电纺成PANi/SF导管。植入大鼠体内12个月后，PA/SF NGC的动作电位为正常状态的75%，SFI为-51；SF NGC的仅34%，SFI为-70。这些结果表明，导电NGC表现出比非导电NGC更好的神经损伤修复性能。

2.1.3 聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)

在导电聚合物中，聚噻吩的聚合物由于具有广泛的电子、电化学和光学应用前景而备受关注。在此背景下，聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)被认为是最成功的聚噻吩衍生物。它具有高导电性，在氧化态下还表现出异常的环境和电化学稳定性，无细胞毒性，并且与上皮细胞有生物相容性和电相容性，证明它有应用于组织工程的潜力[37]。Wang等[23]制备的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)/壳聚糖/明胶(PEDOT/Cs/Gel)支架无细胞毒性，不仅促进神经干细胞(NSCs)粘附和增殖，还增强了它向神经元和星形胶质细胞的分化。

2.2 石墨烯及其衍生物

石墨烯是一种由碳同素异形体构成的2D蜂窝状晶格，具有出色的导电、热学、光学和机械性能。石墨烯家族有许多成员，如单层石墨烯、氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(rGO)等，已应用于传感器、光电探测器、储能器件、纳米复合材料等领域[38]。利用石墨烯独特的表面和电特性来促进干细胞向神经元的分化，是治疗神经元损伤和疾病的一种极具吸引力的策略。最近，越来越多研究表明，将石墨烯与其他材料结合形成的纳米复合材料可为刺激神经干细胞粘附、增殖、分化和周围神经再生提供出色的平台[39-40]。石墨烯基支架还能与电刺激结合，例如Dong等[8]将石墨烯基导电纤维支架与电刺激组合来修复神经损伤，图3显示了正常组、自体移植组、对照组、电刺激组和一次电刺激组在术后1个月和 3 个月的各项试验结果，其中SSI是指静态坐骨神经功能指数。研究结果表明电刺激显著增强了石墨烯基导电纤维支架植入后神经再生和功能恢复，并且治疗效果与自体移植相当。GO和rGO也已被证实支持SCs的粘附和增殖，有效促进神经再生[24-26]。石墨烯是把双刃剑，高电导率促进了神经再生，但由于π - π堆叠作用强烈，可能对蛋白质、DNA结构和细胞膜产生破坏[41]。目前关于石墨烯、GO、rGO的细胞毒性存在争议，这限制了其潜在的生物医学应用，这可能与其不同制备方法、尺寸和功能化有关[38]。

2.3 碳纳米管(CNT)

碳纳米管是由六角有序的碳原子卷成的薄片，长度通常在微米范围内，它们可能是单壁或多壁的(分别是SWCNT和MWCNT)。CNT表现出可调节的物理特性(长度、直径、壁数、手性)和化学特性(表面功能性和高电化学表面积)。除上述特性外，CNT在结构上的各向异性电导率与神经元电导率有一定相似之处，并且小CNT束的尺寸和树突的尺寸相似，增加了探测、修复、刺激或重新配置神经网络的可能性[42]。尽管许多研究都强调暴露在原始CNT中会对细胞产生毒性影响，但这些不利影响主要是由于在合成过程中产生的重金属纳米粒子造成的。进一步的功能化步骤可以去除这些金属，也可以减少CNT的聚集，从而改善进一步的生物分布和较原始CNT更低的炎症反应[43]。

Yu等[44]利用羧基多壁碳纳米管与生物可降解材料胶原和聚己内酯复合制备NGC，在体外，羧基多壁碳纳米管增强的电纺纤维支持SCs的粘附和伸长，体内研究表明该导管可有效促进大鼠坐骨神经缺损的神经再生，防止肌肉萎缩，而且不会引起机体排斥反应或严重的慢性炎症。虽然许多文献表明，表面功能化可以减轻CNT在体内的毒性，但其长期安全性尚未进行研究，不可生物降解性和长期毒性限制了碳基纳米材料在生物医学领域的应用。

3 导电人工神经导管的制备方法

NGC制备过程中良好的成型方法能够引导细胞生长，从而制备具有特定功能的导管支架。而具有一定电导性的NGC与电刺激协同作用加快周围神经损伤的修复再生已成为共识。为使人工神经导管具有导电性，直接使用导电材料作为导管的主体材料是不可行的，因为导电材料难加工力学性能差。但可将导电材料与其他聚合物混合或共聚来提高机械和流变性能，从而提高其可加工成导管的能力[45]，或者通过对神经导管进行表面处理如涂层、接枝、原位聚合等方法来获得导电NGC。图4显示了神经导管的常用制备技术[46-47]。

图4 神经导管的常用制备技术Fig.4 The common techniques for fabricating nerve conduits

3.1 复合成形

一般可以将导电材料以微细颗粒或溶液的形式与聚合物共混，通过静电纺丝、3D打印、模具法等技术加工成一定长度与直径的NGC。

3.1.1 静电纺丝技术

在周围神经损伤修复中，静电纺丝技术制备的导管材料具有更大的优势。这是由于静电纺丝技术制备的随机或纵向排列的纳米纤维或微纤维可以在纤维结构上模拟天然的细胞外基质，此外，这项技术允许优化和操纵机械、生物和动力学特性，以增强细胞与基材的相互作用[3]。为了利用纳米纤维结构同时考虑到神经细胞的电特性和电刺激对神经细胞的影响，因此导电材料的使用对于构建神经组织工程支架非常有吸引力。为了克服导电材料难加工的问题，多数研究人员通过将导电材料与其他可纺聚合物混合来制备电纺导电纳米纤维薄膜[34]。目前关于电纺导电纳米复合材料的研究已涉及聚吡咯/聚-DL乳酸-聚乙二醇共聚物(PPy/PELA)[19]、改性多壁碳纳米管/聚左旋乳酸(mMWCNTs/PLLA)[28]、聚苯胺/聚左旋乳酸(PANi/PLLA)[48]等。在这些研究中，发现通过电纺制成的导电神经导管有利于神经细胞粘附、增殖和分化，但也存在一些局限性。首先导电材料是不可生物降解的，可能会引发慢性炎症；其次静电纺丝技术无法精确控制导管的孔径、孔隙率和纤维方向；此外该工艺缺乏可重复性，难以扩大规模[45]。

3.1.2 3D打印技术

3D打印是根据三维数字模型，通过逐层堆积的方式制造出复杂精细的任意三维结构的方法。不同于传统的NGC制造方法，3D打印可以制造具有个性化特征和复杂结构的柔性NGC，还可以将支架与细胞和生长因子结合起来模拟细胞外基质，在功能性NGC的构建方面展现出巨大的潜力[49]。该技术提供了一种综合方法，可将天然和合成材料、支持细胞、生长因子以及由医学成像确定的特定于导管接受者的形状/尺寸相结合。但它们的使用存在一些限制，如打印速度有限和分辨率低，这主要受喷嘴的限制[3]。

Vijayavenkataraman等[50]通过电流体动力喷射3D打印技术制备了rGO/PCL导电神经导管，研究发现rGO/PCL支架的机械性能低于纯PCL支架，但其细胞增殖情况比纯PCL支架更好。这种电流体动力喷射成形技术是静电纺丝技术与3D打印技术的完美结合，能够通过调整工艺参数来控制导管的特性即纤维直径、孔径、孔隙率和纤维取向度[45]，具有材料兼容性好、成本低、结构简单、分辨率高等优点[51]。

3.1.3 其他技术

溶剂浇铸是制造多孔3D支架最便宜、最简单的方法，适用于大多数聚合物材料，还可与盐浸工艺结合制备高度多孔的支架结构[46]；微图案化是通过光刻、反应离子蚀刻或各向异性蚀刻等方法在聚合物薄膜表面进行图案化后再卷曲成NGC，这种具有微米级的微通道和凹槽的NGC可以提供有效的神经再生所需的物理线索[52]；芯轴/浸涂也是一种强大的方法，可以生产出厚度和均匀性控制更好的NGC[53]。

3.2 表面处理

细胞和NGC之间的相互作用也是影响神经再生过程的关键因素，因此，对导管表面进行操作和优化，可以最好地反映神经再生的有利生物学条件[53]。可以通过各种方法将导电材料沉积到已经准备好的导管材料上，包括化学气相沉积、溶胶-凝胶、原位聚合和化学镀等[54]。目前常用的导电聚合物如聚吡咯、聚苯胺、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)都可用电化学或化学氧化聚合法合成，因此表面沉积法在高分子修复材料聚合中具有重要意义。Sun等[55]通过“原位聚合”的方法将PPy包覆在静电纺聚乳酸-ε-己内酯/丝素蛋白(PLCL/SF)表面制备了NGC，研究表明该膜具有优异的导电性、机械性能和生物相容性，PPy涂层可促进术后早期SCs的增殖及后期髓鞘的形成，神经再生效果接近自体移植组。在另一项研究中通过对比原位聚合和化学气相沉积法制备的PPy/粘胶导电复合纺织品，发现气相沉积制备的织物在纤维表面显示出高度均匀的PPy涂层，并且PPy部分渗透到纤维本体的无定形区域内[56]。表面沉积技术无论是通过表面喷涂来改善导管表面的粗糙度、促进生长因子和细胞的附着，还是通过多层三维结构来增加导管的比表面积，改变电导率，所有这些都为修复受伤的神经提供了潜在的可能性[47]。

4 总结与展望

具有导电性的人工神经导管在周围神经再生中可以更好地诱导神经再生，在长距离神经缺损的修复中表现出巨大的潜力。聚吡咯、聚苯胺、石墨烯等导电材料在导电性人工神经导管的制备中受到越来越多的关注，这些导电材料具有良好的生物相容性。通过与其他高分子聚合物通过共混、对其他高分子材料进行表面修饰处理(如涂层、化学气相沉积等)使神经导管具有导电性，特别是形成的纳米导电材料可以更好地刺激神经干细胞粘附、增殖、分化，以大大改善神经再生，进而改善周围神经损伤后的功能恢复，缩短修复时间，提高治愈率，减轻患者负担。

然而，当具有适当导电性的材料用于生物医学应用时，存在一些实际问题。首先，这些导电材料具有一定的缺点，主要表现为难加工、难降解性。比如聚吡咯不溶，碳纳米管易团聚与基体材料结合较差，在基体中分散性差。石墨烯的高电导率也可能对蛋白质、DNA结构和细胞膜产生破坏等。未来研究中可以考虑通过表面改性，控制聚合条件、掺杂等手段来改善导电聚合物的这些缺点。其次，电刺激与导电材料的协同作用机制还需要进一步的研究，包括电刺激施加的强度、方式与导电材料的电导率、导管三维结构如何匹配可以发挥最大的协同作用效果，以满足神经长距离缺损修复的需求。再次，导电材料在体内长期的细胞毒性、生物相容性及代谢问题应为未来研究的重点，包括导电材料的用量与基体材料降解速率对机体细胞的毒性，导电材料微观尺寸对机体细胞代谢能力的影响等问题。