黑果腺肋花楸分级提取物成分分析及抗氧化活性比较

杨丽婷，赵珊，李明玉，杨薇潼，郑志强，符群,

1. 东北林业大学（哈尔滨 150040）；2. 黑龙江省植物资源利用重点实验室（哈尔滨 150040）；3. 军事科学院系统工程研究院军需工程技术研究所（北京 100010）

21世纪以来，世界人口年龄结构发生改变，老年人口比例不断增大，人口老龄化成为多数国家都面临的难题[1]；与此同时，不健康的生活方式和社会飞速发展带来的环境污染、电离辐射等影响，使疾病的年轻化程度也逐渐增加[2-3]。机体自然氧化和受到外界干扰均会产生活性氧，其在高浓度时对细胞组织具有损伤作用，从而可诱导多种疾病发生。抗氧化剂能够清除活性氧，进而可以缓解甚至避免氧化应激相关疾病，保护细胞功能和生物系统[4]。因此，随着人们健康保健意识加强，抗氧化研究被社会广泛关注。

黑果腺肋花楸又名黑涩石楠、黑果花楸，原产于北美，由20世纪90年代引入我国[5]。它是集食用、药用、景观、生态、经济五大价值于一体的小型浆果[6]，我国在2018年将其列入新食品原料名录[7]。其果实中含有大量的多酚、多糖、黄酮等活性物质[8]，具有抗氧化[9]、抗炎[10]、抑菌[11]、降血糖血脂[12]等多重功效。作为清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂[13]，原花青素在花楸果中的含量在已知植物果实中居于前位。

将对黑果花楸果实分级提取后的五相提取物进行主要活性成分分析，测定其多酚、黄酮、多糖、原花青素含量，并以VC为对照，分别评价此五相提取物对DPPH·、ABTS+·以及·OH这3种自由基的清除能力，旨在为黑果花楸果实相关功能性产品的开发提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富康源1号（辽宁省鞍山市岫岩县黑果腺肋花楸繁育基地）。

没食子酸标准品（≥98%）、芦丁标准品（≥98%）、葡萄糖标准品（≥99.5%）、儿茶素标准品（≥98%）、DPPH（≥98%）、abts、抗坏血酸（≥98%）、石油醚（沸程40～60 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇、福林酚试剂、香草醛等（分析纯）。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SB25-12DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RT-6000酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；BSA224S-CW电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 花楸果分级提取物的制备

1.3.1.1 粗提物的制备

花楸全果经清洗、粉碎打浆，低温烘干后粉碎，过孔径0.25 mm筛，备用。粗提物的制备采用超声波辅助有机溶剂浸提法，45 ℃条件下，用体积分数80%的乙醇按料液比1∶20（g/mL）、超声波380 W辅助提取60 min，取上清液，旋转蒸发去除有机溶剂，得粗提物，即乙醇提取物（H-1）。

1.3.1.2 分级萃取

将乙醇提取物H-1，用10倍体积蒸馏水溶解，按溶剂极性由小到大顺序（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇）依次进行萃取（多次萃取至每种溶剂萃取至接近澄清无色时，换下一种溶剂萃取，每次均按体积比1∶1加入溶剂）。得石油醚提取物（H-2）、乙酸乙醇提取物（H-3）、正丁醇提取物（H-4）和水提取物（H-5），将各提取物冷冻干燥备用。

1.3.2 分级提取物活性成分的含量测定

分别对各级提取物，以比色法测定多酚、黄酮、多糖、原花青素成分含量。

1.3.2.1 多酚标准曲线的绘制及含量的测定

多酚标准曲线的绘制。采用Folin-Ciocalteu法，参考张文婷等[14]的方法和GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[15]并略作修改。取0，0.1，0.2，0.8，1.6，2.0 mL 1 mg/mL没食子酸标准溶液定容至25 mL，各取0.5 mL，依次加入2.5 mL质量分数10%的福林酚试剂，7 mL质量分数7.5%饱和Na2CO3溶液，室温避光反应30 min，测定760 nm处吸光度。得没食子酸标准曲线y=0.010 9x+0.005 2，R2=0.999 2。

含量的测定。取供试品同标准曲线绘制操作，测得的样液吸光度代入没食子酸标准曲线方程可得出样液中多酚含量。样品中多酚（以没食子酸计）的含量X（%），按式（1）计算。

式中：X1为样品中多酚含量，%；C1为样液中多酚质量浓度，μg/mL；V1为样液体积，mL；N1为稀释倍数；M1为样品质量，g。

1.3.2.2 黄酮标准曲线的绘制及含量的测定

黄酮标准曲线的绘制。采用亚硝酸钠-硝酸铝法，参照周慧恒等[16]的方法。取0，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL 0.2 mg/mL芦丁标准溶液，依次加8 mL水、1.0 mL质量体积比50 g/L NaNO2溶液，反应10 min，加入1.0 mL质量体积比100 g/L的Al(NO3)3溶液，反应10 min，加入4.0 mL质量体积比200 g/L的NaOH溶液，并加水定容至25 mL，反应15 min，测定510 nm处吸光度。得芦丁标准曲线y=0.012x+0.000 6，R2= 0.999 6。

含量的测定。取供试品同标准曲线绘制操作，测得的样液吸光度，代入芦丁标准曲线方程得出样液中黄酮的含量。样品中黄酮（以芦丁计）的含量X（%），按式（2）计算。式中：X2为样品中黄酮含量，%；C2为样液中黄酮质量浓度，μg/mL；V2为样液体积，mL；N2为稀释倍数；M2为样品质量，g。

1.3.2.3 多糖标准曲线的绘制及含量的测定

多糖标准曲线的绘制。采用硫酸-苯酚法，参照钱骅等[17]的方法。取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 0.106 5 mg/mL葡萄糖标准液并定容至1 mL后，依次加入1 mL质量分数5%的苯酚溶液，5 mL浓H2SO4溶液，摇匀室温反应30 min，测定490 nm处吸光度。得葡萄糖标准曲线y=0.050 8x+0.002 8，R2=0.999 1。

含量的测定。取供试品同标准曲线绘制操作，测得的样液吸光度，代入葡萄糖标准曲线方程可得出样液中多糖的含量。样品中多糖（以葡萄糖计）含量X（%），按式（3）计算。

式中：X3为样品中多糖的含量，%；C3为样液中多糖的质量浓度，μg/mL；V3为样液体积，mL；N3为稀释倍数；M3为样品质量，g。

1.3.2.4 原花青素标准曲线的绘制及含量的测定

原花青素标准曲线的绘制。采用浓盐酸-香草醛法，参照纪秀凤等[18]的方法。取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 1 mg/mL儿茶素标准溶液并定容至1 mL后，依次加入6 mL质量体积比5 mg/mL香草醛-甲醇溶液和3 mL浓HCl溶液，30 ℃水浴避光反应1 h，测定500 nm处吸光度。得儿茶素标准曲线y=0.004 9x+ 0.002 6，R2=0.999 8。

含量的测定。取供试品按标准曲线绘制同操作，测得的样液吸光度，代入儿茶素标准曲线方程可得出样液中原花青素的含量。样品中原花青素（儿茶素计）含量X（%），按式（4）计算。

式中：X4为样品中原花青素含量，%；C4为样液中原花青素质量浓度，μg/mL；V4为样液体积，mL；N4为稀释倍数；M4为样品质量，g。

1.3.3 分级提取物体外抗氧化活性的测定

将分级提取物和VC标准品分别配制成适宜的不同浓度梯度，通过对DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率测定，对分级提取物的体外抗氧化活性进行评价。

1.3.3.1 DPPH·的清除能力

参照黎英等[19]的方法，并稍作修改。取3支试管，1号试管为2.0 mL待测液+2.0 mL DPPH-乙醇工作液，记为A1i；2号试管（样品对照）为2.0 mL待测液+2.0 mL无水乙醇，记为A10；3号试管（空白对照）为2.0 mL无水乙醇+2.0 mL DPPH-乙醇溶液，记为A1j。避光反应30 min，离心后取上清液，以无水乙醇为参比并以VC做对照，测定517 nm处吸光度，按式（5）计算。

1.3.3.2 ABTS+·清除能力

参照张乃珣等[20]的方法，并稍作修改。取3支试管，1号试管：0.1 mL待测液+1.9 mL ABTS工作液，记为A2i；2号试管（样品对照）：0.1 mL待测液+1.9 mL无水乙醇，记为A2j；3号试管（空白对照）：0.1 mL无水乙醇+1.9 mL ABTS工作液，记为A20。摇匀避光反应6 min，以无水乙醇为参比并以VC做对照，测定734 nm处吸光度，按式（6）计算。

1.3.3.3 ·OH 清除能力

参照李瑞光等[21]的方法，并稍作修改。取3支试管，1号试管为1 mL待测液+1 mL FeSO4+1 mL水杨酸-乙醇溶液+1 mL H2O2，记为A3i；2号试管（样品对照）为1 mL待测液+1 mL FeSO4+1 mL水杨酸-乙醇溶液+1 mL无水乙醇，记为A3j；3号试管（空白对照）为1 mL无水乙醇+1 mL FeSO4+1 mL水杨酸-乙醇溶液+1 mL H2O2，记为A30。摇匀避光反应6 min，以无水乙醇为参比并以VC作为对照，测定510 nm处吸光度，按式（7）计算。

1.4 试验结果统计分析

试验均平行3次，数据取平均值±标准偏差表示，试验数据统计分析采用Excel 2016软件和SPSS 26.0软件，采用Origin 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 分级提取物活性成分含量的测定

为研究不同极性的花楸果有机溶剂提取物中标志性活性成分含量与其抗氧化活性关系，采用不同极性有机溶剂对花楸果依次进行萃取，并对不同极性提取物中的标志性活性成分含量进行测定。其中，不同极性提取物中活性成分含量如图1所示。结果表明，多酚含量为H-1＞H-3＞H-4＞H-5＞H-2；黄酮含量为H-4＞H-3＞H-1＞H-2＞H-5；多糖含量为H-5＞H-4＞H-1＞H-3＞H-2；原花青素含量为H-4＞H-1＞H-3＞H-5＞H-2。总体来看，正丁醇提取效果最佳，各活性成分含量均较高，石油醚相提取效果最差，各活性成分含量均为最低。这可能与各活性成分的极性大小及有机溶剂的极性大小存在一定关系，具体原因尚有待验证。

图1 5种分级提取物活性成分含量

2.2 分级提取物体外抗氧化活性评价

2.2.1 DPPH·清除能力评价

DPPH法是广泛应用于评价天然物质抗氧化效果的方法之一，在含氢天然抗氧化物质存在下，DPPH被还原为DPPH-H，从而导致溶液发生褪色[22]。图2、3为分级提取物对DPPH自由基清除能力结果。由图2和图3可知，以VC为阳性对照，在0～10 mg/mL质量浓度范围内，花楸果的分级提取物均对DPPH自由基具有较好清除能力，且清除率均随着分级提取物质量浓度的增加而增加。清除DPPH自由基的IC50分别为：H-1 0.191 0±0.016 8 mg/mL、H-2 2.785 7±0.328 0 mg/mL、H-3 0.177 3±0.017 0 mg/mL、H-4 0.127 7± 0.011 2 mg/mL、H-5 1.152 3±0.158 9 mg/mL、VC对照组0.017 0±0.001 0 mg/mL。IC50随着清除能力升高而降低，因此分级提取物对DPPH自由基清除能力的大小顺序为VC＞H-4＞H-3＞H-1＞H-5＞H-2。

图2 分级提取物对DPPH自由基的清除作用

图3 石油醚提取物对DPPH自由基的清除作用

2.2.2 ABTS+·清除能力评价

ABTS+·被氧化可形成稳定的蓝绿色自由基，加入具有抗氧化能力的样品时，溶液会发生褪色[23]。图4和图5为分级提取物对ABTS+·的清除结果。以VC为阳性对照，在质量浓度0～20 mg/mL范围内，花楸果分级提取物对ABTS自由基清除能力均随着分级提取物质量浓度的增加而提高。清除ABTS自由基的IC50分别为H-1 0.618 3±0.064 7 mg/mL、H-2 3.093 7±0.222 9 mg/mL、H-3 0.298 7±0.020 0 mg/mL、H-4 0.179 7± 0.004 0 mg/mL、H-5 1.590 7±0.156 3 mg/mL、VC对照组0.066 7±0.004 0 mg/mL。依据分级提取物的IC50，得分级提取物对ABTS自由基清除能力的大小顺序依次为VC＞H-4＞H-3＞H-1＞H-5＞H-2。

图4 H-4、H-3、H-1对ABTS自由基的清除作用

图5 H-5、H-2对ABTS自由基的清除作用

2.2.3 ·OH 清除能力评价

·OH是对生物体危害最大的一种自由基，可使蛋白质、核酸等物质发生氧化和损伤，导致细胞坏死或突变，被广泛应用于测定样品的抗氧化能力[24]。分级提取物对羟自由基的清除结果如图6和图7所示。以VC为阳性对照，在质量浓度0～40 mg/mL范围内，花楸果的分级提取物均对羟自由基具有一定清除能力，且清除率随着分级提取物质量浓度增加而增加，基本呈正相关趋势。分级提取物清除·OH的IC50分别为H-1 6.054 0±0.005 7 mg/mL、H-2 7.131 0±1.108 7 mg/mL、H-3 4.587 7±0.288 7 mg/mL、H-4 0.994 7± 0.035 5 mg/mL、H-5 7.117 0±0.246 0 mg/mL、VC对照组0.227 0±0.007 5 mg/mL。因此分级提取物对羟基清除能力的大小顺序为VC＞H-4＞H-3＞H-1＞H-5＞H-2。

图6 分级提取物对羟自由基的清除作用

图7 H-2对羟自由基的清除作用

3 结论

5种黑果腺肋花楸果实不同极性的提取物对DPPH、ABTS、羟自由基均体现出一定的清除能力，且不同极性部位的抗氧化活性差别较大，但其抗氧化能力均低于VC，这与宋健刚[25]研究结果不太一致，可能是试验所用提取方法及有机溶剂不同导致。正丁醇提取物具有较好的体外抗氧化能力，对3种自由基的清除能力均为最强，其次是乙酸乙酯提取物和乙醇提取物，水提取物略低，石油醚提取物清除效果最弱。分级提取物的体外抗氧化活性可能与多酚、黄酮、多糖、原花青素的含量有关，正丁醇提取物中活性成分含量均较高，其体外抗氧化活性最优，这与高凝轩等[26]、刘静等[27]、滕飞[28]、刘玉婷等[29]的研究结果基本一致。

从研究结果来看，乙醇提取物中多酚含量为5种提取物中最高，为174.970 0±1.047 2 mg/g，但其抗氧化能力仅居第3位；水相提取物中多糖含量最高为172.924 0±2.009 0 mg/g，但其自由基清除能力位列第4位；乙酸乙酯提取物各个活性成分含量均居于中位，尤其是原花青素含量（29.450 0±0.014 2 mg/g）和黄酮含量（15.796 0±0.025 9 mg/g）较为靠前，其自由基清除能力位于第2位，而正丁醇提取物中黄酮（17.700 0±0.029 1 mg/g）及原花青素含量（57.958 0± 0.242 2 mg/g）位于首位，正丁醇提取物的体外抗氧化能力亦为最强。因此，正丁醇提取物及乙酸乙酯提取物可能是黑果腺肋花楸果实抗氧化的主要活性部分，且黑果腺肋花楸果实提取物抗氧化能力应为多种活性成分共同作用的结果，且可能与原花青素含量和黄酮含量相关性较强。试验尚未对花楸果分级提取物抗氧化能力与活性单体成分的含量进行相关性分析，会在后续研究进行细化补充。

综上，黑果腺肋花楸果实不同极性提取物中体现出活性成分分布的显著差异，黑果腺类花楸果实正丁醇提取物及乙酸乙酯提取物活性成分含量相对较高，抗氧化作用相对较强，因此可将2种提取物作为研究重点，进一步分离筛选其抗氧化活性的主要成分。本研究在促进林下经济发展、满足林区经济转型发展内涵[30]的同时，指导了有别于传统加工的产业模式探索，更好地为黑果腺肋花楸作为天然抗氧化剂应用于食品药品研发、按需加工、延长产业链、实现全果的高附加值开发提供理论基础。