不同类型脂质体稳定性的比较研究

王寅，刘雪梅，徐叶，赵利，白春清

江西科技师范大学生命科学学院（南昌 330013）

薏苡仁油（Coix seed oil，CSO）是薏苡仁或薏苡仁加工副产物麸皮中提取出的油脂或脂溶性功能成分混合物[1]。CSO中有薏苡仁酯、薏苡仁素、生育酚等功能成分，其中薏苡仁酯是CSO中不饱和脂肪酸2，3-丁二醇的总称，对抑制癌细胞增殖、促进其凋亡具有积极作用。β-胡萝卜素是一种脂溶性的天然色素，具有一定的抗氧化活性[1]，但在光、热等条件下极不稳定。为增强β-胡萝卜素-薏苡仁油体系的稳定性，此次试验采用脂质体包埋技术将其包裹。

脂质体是由脂质双分子层构成的封闭囊泡[2]，具有类似细胞膜结构，能够包埋水溶性、油溶性以及两亲性活性物质，在活性物质包埋方面应用广泛[3]。但因膜材自身组成易于氧化，外界胃肠道消化稳定性欠佳等问题，脂质体并不适用于直接口服食用[4-5]。聚合物具有较好的生物相容性和生物可降解性。研究表明采用聚合物对其表面进行修饰，可解决脂质体的上述缺陷。壳聚糖作为唯一的聚阳离子多糖[6]，因其具有较好的抗菌性、生物相容性、生物降解性、低毒性、价格低廉等优点，是应用最广泛、最有前途的脂质体表面修饰聚合物[7-8]。果胶是从高等植物细胞壁中层提取的具有生物相容性阴离子多糖类聚合物[9-10]，因无毒无害且具有凝胶特性，在食品和药品中发挥越来越重要的角色。有研究表明，利用聚合物间的异电性，采用改进的制备技术，可在脂质体表面进行双层甚至多层修饰以提高稳定性。Liu等[11]利用层层自组装技术制备了壳聚糖和海藻酸盐双层修饰的脂质体，结果发现与单层修饰脂质体、常规脂质体相比，双层修饰脂质体具有更高的物化稳定性和体外消化稳定性。课题组前期也曾采用聚电解质络合技术，利于果胶、壳聚糖的异电性构建了果胶、壳聚糖双层修饰脂质体，对其工艺要求、结构特性及形成机制、消化利用情况等进行了系统研究[12]，但其作为新型载体在常规食品加工或贮藏条件下的稳定性未进行评价。

因此，此次试验以粒径、电位为主要指标对常规脂质体、壳聚糖单层修饰脂质体和果胶-壳聚糖双层修饰脂质体三种不同类型脂质体的温度稳定性、冻融稳定性及pH稳定性进行深入研究，为聚合物修饰脂质体的开发以及脂质体的工业化应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖（Solarbio公司）；果胶（Sigma-Aldrich公司）；蛋黄卵磷脂（上海蓝季科技发展有限公司）；薏苡仁油（广州合诚三先生物科技公司）；胆固醇（天津市大茂化学试剂厂）；上述所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

N-1100旋转真空蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；Nicomp 380微粒粒度分析仪（上海奥法美嘉公司）；ZetaCAD Zeta电位测定仪[仪思奇（北京）科技发展有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 常规脂质体的制备

采用乙醇注入法制备常规脂质体，将蛋黄卵磷脂、胆固醇（质量比5∶1）及6 mg薏苡仁油完全溶解于10 mL的无水乙醇中，得到油相。准确量取25 mL磷酸盐缓冲液，于磁力搅拌器加热至45 ℃得水相，然后用滴管分数次将油相滴入水相中，继续恒温搅拌20 min。接着将其于45 ℃真空旋转蒸发除去乙醇形成薄膜，至溶液无气泡产生，继续蒸发15 min，测定体积并补加蒸馏水至25 mL，得到常规脂质体。

1.3.2 壳聚糖修饰脂质体的制备

将常规脂质体按照体积比1∶ 1缓慢滴入至壳聚糖乙酸溶液（0.2%wt）中，滴完后继续搅拌20 min，得到壳聚糖修饰脂质体（制备过程中保持室温磁力搅拌状态）。

1.3.3 果胶-壳聚糖修饰脂质体的制备

将羧甲基壳聚糖修饰脂质体按照体积比1∶1缓慢滴入果胶磷酸盐溶液（0.06%）中，滴完后继续搅拌20 min得到果胶-壳聚糖修饰脂质体（制备过程中保持室温磁力搅拌状态）。

1.3.4 温度稳定性考察

将上述3种样品分装于小试管中（每支试管3 mL），分别于60，70，80，90和100 ℃加热30 min，水浴加热完成后取出，并立即放入冷水中，冷却至室温。另取上述3种样品，分别置于80 ℃水浴加热5，15，30，45和60 min后，立即放入冷水中冷却，分别测定3种脂质体的电位、粒径大小及分布，考察产品的温度稳定性。

1.3.5 冷冻稳定性考察

将上述3种样品，按每支试管10 mL，分装于小试管中，放冰箱冷冻24 h后，用冷水解冻后，继续放入冰箱冷冻，测定样品分别经过1～5次循环冷冻后的电位、粒径大小及分布，考察产品的冷冻稳定性。

1.4 数据处理

试验数据通过SPSS 23.0软件进行显著性差异分析，用Microsoft Excel 2010处理并绘制图表，小写字母（a，b，c，d和e）表示同一脂质体在不同条件下的差异性，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 温度稳定性研究

热处理是几乎所有液态食品走向市场前必须经历的关键加工工序。热处理可破坏病原微生物、降低腐败微生物数量，达到延长食品保质期的目的。但在热处理过程中，也会对食品的感官产生影响，如降低液态食品的稳定性，产生聚集、沉淀等现象，产生不良风味，从而影响消费者的感官可接受度。此次试验以粒径、电位为主要指标，系统研究了3种脂质体不同加热温度、加热时间下的稳定性，为脂质体的工业化生产提供参考。

比较新鲜制备的3种脂质发现，常规脂质体经聚合物修饰后，粒径大小和表面电荷都发生一定程度的改变。推测可能是由于壳聚糖在醋酸溶液中带大量正电荷，当其与带负电的脂质体接触时，通过静电吸附作用发生结合，在脂质体表面形成一层保护层，在增大其粒径的同时，中和脂质体表面原有的负电荷，使其带一定量的正电荷[13]。果胶再次修饰后的P-C-L的平均粒径为306.25±0.8 nm，电位值为28.41±0.61 mV，这可能是带负电荷的果胶通过静电相互作用与壳聚糖发生络合，一方面中和了C-L上的部分正电荷，降低了粒子的带电性，另一方面由于相互结合使壳聚糖层致密，而使其粒径略微降低[14-15]。

同种脂质体不同温度加热处理的比较分析结果显示，随着加热温度的升高，3种脂质体的平均粒径均有不同程度的增加。其中：L经60～80 ℃加热处理后，粒径变化不大，不同处理温度间不存在显著性差异；但经90～100 ℃加热处理后粒径有所升高。对于C-L样品，60，70和80 ℃加热处理组间不存在显著性差异，≥90 ℃加热处理可使其粒径有所增加，且加热温度越高，粒径增大幅度越大。而不同温度加热处理对P-C-L的粒径影响较大，≤70 ℃加热处理对其粒径影响较小，而高温加热（≥80 ℃）将引起P-C-L粒径增大，且粒径大小与温度高低呈正相关。综上，3种脂质体的粒径热稳定性为L＞C-L＞P-C-L。课题组前期研究发现，修饰脂质体的形成机制主要为静电相互作用及氢键相互作用，皆为非共价相互作用，修饰层与脂质体间及修饰层间结合力较弱。较高温度的处理可能会破坏修饰层间及修饰层与脂质体间的相互作用，使修饰层较为松散，而引起粒径增大[16]。

Zeta电位的绝对值和悬着液的稳定程度密切相关，一般来说，Zeta电位绝对值越大，微粒间排斥力越大，可有效抵抗粒子间的聚集，提高体系的稳定性；相反，体系的Zeta电位数值越低，粒子之间的吸引力越大，粒子间容易出现聚集，甚至产生沉淀现象，体系稳定性较小[17]。

图2为不同温度加热30 min后样品的Zeta电位值变化情况。结果显示，经不同温度处理3种脂质体的电位值虽有起伏，但差异不大，即加热并未改变粒子的表面电位大小。

图2 脂质体经不同温度加热30 min后的平均电位

为进一步评价脂质体的热稳定性，此次试验考察了80 ℃水浴加热不同时间（5，15，30，45和60 min）对3种脂质体稳定性的影响。结果表明，L和C-L的平均粒径在整个加热时间范围内变化不大，相同样品在不同时间不存在显著性差异。加热处理会使P-C-L粒径显著提高。图3显示，加热5 min后其粒径比未加热前增大75 nm，但在加热30 min内样品的粒径间差异不显著。当加热时间延长至45 min时，粒径有所降低，而更长时间的加热（60 min）可能引起P-C-L修饰层松散程度较为严重，而导致平均粒径大幅度升高。

图3 脂质体经80 ℃加热不同时间后的平均粒径

从图4可以看出，随着加热时间的延长，3种脂质体的Zeta电位均出现一定的起伏，但差异性不大，与新制备的样品相比也基本无差异。综合粒径结果可得知，L和C-L的80 ℃热稳定性较好，但热处理会引起修饰层松紧性改变而导致P-C-L粒径整体增大，但并未引起P-C-L粒子间的聚集及结构的改变。

图4 脂质体经80 ℃加热不同时间后的平均电位

2.2 冷冻稳定性

从图5可发现，冻融处理会引起脂质体粒径增大。经过第1次冻融后，L和C-L的粒径与新鲜样品差异不大，但P-C-L的平均粒径显著增大，其外观则从澄清的淡黄色液体变为黄色悬浊液，并出现明显的沉淀聚集物。随着冻融次数的增加，所有样品的粒径都有所增大，其中以C-L样品增速最为缓慢，经过5次冻融处理后，粒径增大87 nm；对于常规脂质体，2～4次冻融处理后样品间不存在显著性差异，经过5次冻融处理后平均粒径增至（324±1.7）nm，比新制备样品增大177 nm；而P-C-L随着冻融处理次数的增加，聚集沉淀程度加剧，甚至高达21 μm，不适于进行粒径的测定，因此图5未显示。

图5 脂质体样品在反复冻融下的平均粒径

电位结果如图6所示。经过一次冻融处理后，C-L和P-C-L的电位值显著降低，反复多次冻融对C-L的电位值影响较小，P-C-L的电位虽有波动，但不存在显著性差异。对于修饰脂质体，聚合物间以及聚合物与脂质体间的相互作用源于静电相互作用、氢键相互作用，都属于非共价相互作用，结合力较弱。外加试验所采用的冷冻过程为慢速冻结，冰晶形成过程较慢，在冰峰由外向内迁移过程中破坏了修饰层间以及修饰层与脂质体表面的相互作用，导致修饰层脱落，影响了粒子的界面电位[18]。

图6 脂质体样品在反复冻融下的平均电位

2.3 pH稳定性

经测定发现新制备的常规脂质体pH接近中性，而两种修饰脂质体的pH呈酸性。调整体系pH后，3种脂质体样品的平均粒径和电位值如图7和图8所示。常规脂质体的平均粒径受pH的影响较小，而pH变化对C-L及P-C-L的粒径大小影响较大，C-L的粒径在pH 7时快速增加到893.9±10.4 nm。P-C-L的平均粒径在不同pH条件下差异显著，其中以pH 7时粒径最大（P＜ 0.05）。在整个pH区间，L的粒径的变化较小。有研究表明脂质体结构受pH变化的影响较小，几乎不会被破坏，这可能是由于脂质体中的磷脂和胆固醇自身的结构特性以及它们之间通过氢键结合的方式，在一定程度上维持了脂质体结构的稳定性，pH的改变对其结构基本不造成破坏[16]。

图7 脂质体样品在不同pH下的平均粒径

图8 脂质体样品在不同pH下的平均电位

而对于修饰脂质体而言，C-L的形成主要是利用壳聚糖分子中带正电荷的氨基与磷脂分子中带负电的磷酸基团之间的静电相互作用产生；而P-C-L则再由带负电果胶分子中的羧基与带正电壳聚糖中的氨基通过氢键及静电相互作用实现[19]。壳聚糖作为一种阳离子的多糖，在低pH条件下易溶解，且带正电荷，但当pH大于5时，则溶解性下降，甚至沉淀析出；果胶作为一种阴离子多糖，分子中的羧基电离后带一定量的负电荷，在碱性环境下具有较高的溶解度，但在酸性条件下易于析出，pH的改变会影响二者的带电性和溶解性，从而影响二者以及壳聚糖与脂质体间的相互作用，进而影响修饰脂质体的修饰层的紧密度及粒径大小。调节pH后，常规脂质体的表面带电状态发生了变化，加剧了脂质体体系的不稳定，常规脂质体样品的表面电荷绝对值变小，两种修饰脂质体样品的平均粒径和Zeta电位也剧烈变化。尤其是在pH 5以后，修饰脂质体的粒径明显升高，可能是调节pH后，在pH 7的条件下壳聚糖和果胶的之间的静电相互作用会因为壳聚糖的溶解度下降甚至沉淀析出而变弱，使修饰脂质体相互粘结聚集，粒径变大。而在pH 3的条件下，P-C-L粒径增大，可能与果胶的溶解度下降有关。

3种脂质体在pH 7条件下的贮藏稳定性结果如图9和图10所示。可以看出，随着贮藏时间的增加，3种脂质体的粒径均有不同程度的增大。L的粒径在37 ℃ pH 7的条件下1～3 d内无明显增加，但在第6天增幅明显，并出现显著性差异；在6～15 d内粒径有一定程度的改变，但随着贮藏时间的增加，粒径并没有显著性差异。推测可能是储藏期间，在较高温度下，磷脂分子的动能增大，脂质体膜的流动性增强，体系发生了粒子的聚集或融合现象，导致粒径增大。C-L的粒径随着时间的延长呈现显著性升高现象，并伴随电位持续性降低，说明在37 ℃ pH 7的条件下C-L的稳定性较差。P-C-L的粒径在6～9 d时显著增大，但在＞9 d时，未表现出显著性差异。图10显示，在整个贮藏期，3种脂质体的电位虽有波动，但差异性不显著，且呈整体下降趋势，分析原因可能是3种脂质体中的主要膜材磷脂易于氧化，37 ℃下产生的酸性氧化产物吸附在粒子表面，提高了其电负性。有研究报道壳聚糖具有抗氧化活性，且壳聚糖修饰可以提高脂质体的贮藏稳定性[20]，但因试验是在pH 7环境条件下，壳聚糖溶解性低引起的P-C-L及C-L失稳，导致其对体系的维稳方面未表现出明显优势。3种脂质体在不同pH条件下的贮藏稳定性有待进一步验证。

图1 脂质体经不同温度加热处理30 min后的平均粒径

图9 脂质体样品在37 ℃，pH 7下贮藏15 d的平均粒径

图10 脂质体样品在37 ℃，pH 7下贮藏15 d的平均电位

3 结论

此次试验以平均粒径及Zeta电位为主要评价指标对常规脂质体、壳聚糖修饰脂质体和果胶-壳聚糖多层修饰脂质体的温度稳定性、冻融稳定性以及pH稳定性进行了系统考察。结果表明：常规脂质、壳聚糖修饰脂质体具有较好的热稳定性，能耐80 ℃长时间加热，而果胶-壳聚糖修饰脂质体的耐受温度较低，高温加热易引起粒径变大，但未改变其结构特性；壳聚糖修饰脂质体具有最佳的冻融稳定性，其次为常规脂质体；常规脂质体的pH稳定性优于修饰脂质体，pH的改变会影响聚合物的溶解度，从而改变其聚合物修饰的粒径大小及界面电位，修饰脂质体在37 ℃ pH 7的条件下贮藏稳定性较差。