复菌发酵对混果馅料营养成分及挥发性物质变化的影响

刘禹志 ，赵文俊，符树勇 ，张诚 ，杜冰，方嘉沁 *

1. 广州酒家集团利口福食品有限公司（广州 511442）；2. 华南农业大学食品学院（广州 510642）；3. 广州酒家集团粮丰园（茂名）食品有限公司（茂名 525000）；4. 广州市广式焙烤食品加工工程技术研究开发中心（广州 511442）

龙眼、荔枝和芒果常见于我国海南、广东等热带和亚热带省份，其果肉鲜嫩多汁、营养可口，它不仅富含钙、镁、磷等多种矿物质和核黄素、烟酸等维生素，还含有多种抗氧化活性物质如槲皮素、原花青素等类黄酮物质，对人体多有裨益[1-2]。龙眼（Dimocarpus longan Lour.）亦称“桂圆”，盛产于我国华南地区。龙眼具有壮阳益气、补心益脾、润肤美容、延年益寿等功效，可以治疗或改善贫血、心悸、神经衰弱等症状[3]。芒果（Mangifera indicaL.）是我国广西、海南、四川和云南等热区农业的支柱产业，芒果果实富含糖、蛋白质、粗纤维，并且所含有的维生素A的前体胡萝卜素成分特别高，是所有水果中少见的。但是这些季节性水果采收后不易贮存而导致腐烂的问题，给食品工业造成巨大的损失[4]，如何保持农产品的价值成为现实亟需解决的问题。近年来，为满足人们不同人群口味的需求，焙烤行业迅猛发展，特别是中秋时节的特色月饼层出不穷，这引起了广大消费者的青睐，从而为荔枝、龙眼、芒果的混果馅料的加工提供新思路。

复合益生菌发酵因其在增强风味、强化发酵性能、提高发酵效率等[5]方面有着重要的作用而备受青睐，相较于单菌发酵，经多菌种协同发酵后，产品风味可以得到很大改善[6]。例如，贾瑞娟等[5]利用复合菌种发酵生产的陈醋，其产品的风味显著提高。众所周知，植物乳杆菌在风味发酵食品中起着重要的作用；DU-106是一种具有极高增殖能力的好氧型产乳酸芽孢杆菌，其基因组缺乏编码致吐毒素合成酶、肠毒素FM和细胞毒素K的毒力基因，此外，Hoang等[7]也综述了芽孢杆菌是比乳酸菌更耐pH、更广谱的细菌素，可作为一种生物防腐剂。因此DU-106极具有成为食品工业中益生菌发酵剂和防腐剂的潜力。

试验旨在利用植物乳杆菌复合DU-106发酵荔枝、龙眼、芒果的混果馅料并探究其营养成分变化和挥发性物质变化，为农产品的深加工提供理论基础，同时，对开发一款绿色健康的水果饮料有积极的推动作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

新鲜荔枝、芒果和龙眼，购于广州市天河区五山超市；菌种选用乳酸芽孢杆菌DU-106以及植物乳杆菌，由华南农业大学新资源与功能性原料研究及评价中心鉴定及保藏；乳酸标准品试剂（上海源叶生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

PHS-3C型PH计（上海精密科学仪器有限公司）；UV-1100型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；DHP600型电热恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器厂）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；QP2010 Ultra型气相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料前处理

选用新鲜荔枝、龙眼和芒果去皮去核后，按照质量比3∶1∶2置入打浆机形成混合水果匀浆。将打好的混合水果浆液置于灭菌锅中100 ℃蒸煮30 min，冷却后接种复合菌种得到混果馅料，复合菌比例为植物乳杆菌∶乳酸芽孢杆菌DU-106=1∶1，接种量为混合果浆匀浆质量分数的0.1%，培养箱温度设定参数为28 ℃，每隔24 h测定发酵液的营养成分及挥发性物质。

1.3.2 发酵混果馅料营养成分的测定

1.3.2.1 pH的测定

使用PHs-3C型pH计直接进行测定。

1.3.2.2 总酸的测定

参照GB/T 12456—2008[8]中酸碱滴定法测定混果馅料样品的总酸含量（以乳酸计，g/kg）。

1.3.2.3 可溶性固形物的测定

利用糖度计测定其中的可溶性固形物含量。

1.3.2.4 还原糖的测定

参考GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》[9]进行测定。

1.3.2.5 乳酸的测定

乳酸的测定将参照GB 5009.157—2016[10]中有机酸测定方法进行。色谱条件：Amnex HPX-87H色谱柱；流动相选用浓度为0.1%的磷酸水溶液；流速400 μL/min；柱温40 ℃；紫外检测器波长210 nm；手动进样量20 μL。

1.3.3 发酵混果馅料挥发性物质的测定

利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定混果馅料发酵前后的挥发性成分。

1.3.3.1 样品前处理

参照雷冬明等[11]的方法，对混果馅料发酵液进行预处理。首先将固相微萃取针头预先老化，将上述制得的混果馅料准确称取4 g送入15 mL顶空瓶中，在40 ℃的条件下水浴加热30 min，随后将老化好的萃取针头插入顶空瓶，顶空萃取在40 ℃恒温的条件下进行30 min，随后置入GC-MS进样口处在250 ℃下解吸2 min。

1.3.3.2 色谱条件

色谱柱选用HP-5毛细管柱；挥发性物质升温程序：选用不分流进样模式，初始温度40 ℃，柱温40 ℃，保持3 min。然后以5 ℃/min的升温速率使温度升至150 ℃，保持1 min。最后以10 ℃/min的升温速率使温度升至230 ℃，保持1 min；载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min。

1.3.3.3 质谱条件

质谱调谐类型为EI模式，电子能量为70 ev；离子源温度230 ℃，MS四极杆温度150 ℃；接口温度250 ℃；质量扫描范围30～400 amu；溶剂延迟为1.00 min；EM设置为增益因子1.003。

1.3.4 数据处理

试验样品进行三次平行测定，利用图谱检索对应物质进行定性定量分析，使用GraphPad Prism 7作图并分析数据。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对混果馅料营养成分的影响

2.1.1 发酵时间对混果馅料pH的影响

由图1可知，混果馅料的初始pH为4.5，发酵初期的混果馅料的pH随着发酵时间的增加而逐步降低，主要是由于两种产乳酸的菌种利用混果馅料中的乳糖发酵产生乳酸，导致体系内的pH下降。在发酵中期至后期的pH趋于稳定，发酵第7天pH为3.4，其原因一方面，可能是由于混果馅料发酵液中乳糖的含量减少，益生菌进入停滞生长状态，导致乳酸产生量减少甚至停止产生乳酸[12-13]。另一方面是由于发酵产生乳酸使得H+浓度过高，抑制了菌种的生长，甚至导致菌种的自溶现象[14]。发酵液维持在一定的pH可以提高混果馅料的保藏性能，同时，适宜的pH还能增加混果馅料的风味和口感[6]。因此，发酵后的混果馅料其pH维持在3.4，能延长果浆的货架期。

图1 发酵时间对混果馅料pH的影响

2.1.2 发酵时间对混果馅料总酸和乳酸的影响

由图2和图3可知，混果馅料总酸和乳酸的含量随着发酵时间的延长而在不断上升，这是因为乳酸菌和乳酸芽孢杆菌不断产酸的结果。发酵前混果馅料总酸含量0.97 g/kg，发酵1周后总酸的含量高达14.22 g/kg，发酵前乳酸的含量为1.1 mg/g，发酵一周后达到了15.0 mg/g，这与图1中发酵体系中pH的下降相对应。乳酸含量的整体上升是总酸含量上升的关键因素，乳酸菌通过EMP途径的主要代谢产物便是乳酸[15]。相关研究发现产酸芽孢杆菌与乳杆菌复合发酵能够刺激乳杆菌提高其产酸能力[16]；贾瑞娟等[5]利用芽孢菌和醋酸菌、乳酸菌发酵山西老陈醋结果表明芽孢菌能够提高产品的风味。吴姗姗等[17]利用酿酒酵母171和乳酸芽孢杆菌DU-106发酵佛手果，结果表明随着发酵时间的延长，发酵佛手果酒中pH和可溶性固形物的含量逐渐下降，感官评分增加，说明混菌发酵增强了香气复杂性和层次感[18]。试验研究结果表明混果馅料中乳酸含量提高，拥有良好口感和风味。

图2 发酵时间对混果馅料总酸的影响

图3 发酵时间对混果馅料乳酸的影响

2.1.3 发酵时间对混果馅料还原糖和可溶性固形物的影响

由图4和图5可知，混果馅料初始还原糖含量为5.63 g/100 g，随着发酵时间的延长，还原糖含量逐步下降至发酵结束的4.95 g/100 g，可溶性固形物含量由发酵前的17.10%下降至发酵后的15.83%。这可能是因为还原糖是乳酸菌的发酵原料，供给乳酸菌繁殖和新陈代谢所需能量，故呈现下降趋势，而发酵后还存在大量的还原糖和可溶性固形物，而且越到发酵后期，混果馅料中还原糖和可溶性固形物的含量趋于稳定，可能是由于乳酸菌利用混果馅料中的乳糖而无法利用其他的糖类导致的，这与发酵后期pH的变化和总酸上升至趋于稳定的结果相一致，这也可以说明发酵液中没有感染其他的杂菌，发酵状态良好。试验结果表明，发酵后还原糖的含量并没有急剧下降，说明其主要营养成分的变化不明显，而且适当的糖含量能增加馅料的甜度，平衡pH下降导致过酸。

图4 发酵时间对混果馅料还原糖的影响

图5 发酵时间对混果馅料可溶性固形物含量的影响

2.2 混果馅料发酵时间对混果馅料挥发性成分的影响

2.2.1 发酵时间对混果馅料挥发性物质变化的影响

试验利用气相色谱—质谱联用技术（GC-MS）来对混果馅料样品中的挥发性物质进行测定，分析结果见表1和图6。未发酵前（发酵第0天）共检测出27种挥发性物质，随着发酵的进行，最多共产生47种挥发性物质，发酵最后1天共检测到24种挥发性物质，可以看出发酵过程中挥发性物质先增加后减少的趋势，为了探究混果馅料中风味的变化，将挥发性物质进行归类处理。

图6 不同发酵时间混果馅料中挥发性物质气相色谱图

表1 发酵时间对混果馅料挥发性物质的影响

2.2.2 发酵时间对混果馅料挥发性物质种类的影响

如图7（A）所示，随着发酵进程的延长，醇类物质的变化呈波动的趋势，但总体的含量略微下降，由发酵前的9.01%降低至发酵结束后的7.79%。发酵过程中检测出芳樟醇、香茅醇、香叶醇等物质，芳樟醇作为全世界广泛使用的香料，其带有茶香，而香茅醇、香叶醇则带有玫瑰和水果的香味，这些物质都赋予了混果馅料的特别气味[19-20]。如图7（B）所示，发酵后烯类物质是荔枝主要的挥发性成分，占比达到了27.58%，从发酵开始到发酵结束期间不断产生新的烯类物质，而后又被降解。其中蒎烯、月桂烯、罗勒烯是混果馅料主要的烯类物质的来源，并赋予果浆浓郁的果香和松木气味[21-22]。如图7（C）所示，发酵过程中挥发性有机酸的含量上升，达到19.50%。图7（D）显示，挥发性烷类物质随着发酵时间的延长而略微下降，烷烃类挥发性物质曾在甲壳类水产品中被检出，由于它们的阈值较高，因而对其整体的风味贡献不大[23]。图7（E）显示挥发性胺类物质随着发酵时间的延长而下降。从图7可以得出，发酵前后的混果馅料风味差异很大，以醋酸为主的挥发性有机酸含量上升，赋予混果馅料一定的酸味，胺类物质下降可以减轻混果馅料中令人不适的臭味。混果馅料中对风味贡献最大的是醇类和烯类的挥发性物质，几种挥发性物质共同作用构成了混果馅料特殊的风味[24]。

图7 发酵时间对各类挥发性物质变化的影响

3 结论

试验以荔枝、龙眼、芒果为原料制成的混果馅料经过混菌发酵并测定其发酵过程的营养物质和挥发性物质的变化情况，在植物乳杆菌和DU-106菌种1∶1复合发酵过程中，混果馅料中pH下降，还原糖、可溶性固形物含量下降，乳酸和有机酸的含量上升；发酵过程中挥发性物质的变化很大，烯类和有机酸类挥发性物质上升，胺类挥发性物质下降。醇类和烯类物质构成了混果馅料中主要的风味物质。试验结果为开发新型的益生菌发酵工业提供了一定的理论基础，为混菌发酵在食品工业中的应用提供数据支撑。