不同的仓储环境微生物群落对草果陈化品质的影响

冯勇 ,任政伟

(1.重庆商务职业学院 冯勇中式烹调技能大师工作室,重庆 401331；2.四川旅游学院 烹饪与食品实验管理中心,成都 610100)

草果属于姜科豆蔻属多年生草本植物，主要分布于东南亚热带和亚热带地区[1-2]。在我国，大约有30多个该属物种，该属的大部分物种都可以作为食物或药物被使用[3]，特别是在云南地区，草果作为当地重要的经济作物被栽培[4-5]。2020年，草果入选了云南省十大名药材，此外，草果也是重要的药食同源植物，被称为五大香料之一，还被应用在治疗消化系统疾病的药物中[6]。

近代研究结果表明，草果中具有多种生物活性物质，这些物质具有抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种生物活性功能[7]。

微生物多样性与草果的品质关系密切，了解草果储藏过程中微生物多样性和微生物的群落结构[8]，是保障草果品质的关键措施。在草果储藏过程中，国内外对于仓库中的微生物多样性变化相关的研究报道较少[9]。

草果采摘主要在山区，交通不便，故大部分干品草果被保存在当地[10]。由于在不同的仓库中，引起草果品质变化的因素众多，因此草果的品质存在着较大差异。本研究基于此，采用抽样调查的方式，利用宏基因组对样本中的微生物多样性进行研究，同时对不同储藏时间草果中的生物活性酶进行测定，旨在为草果的仓库储藏提供一些理论依据，同时也为草果产业的发展奠定一些基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

1.1.1 草果储藏仓库的选择

草果储藏的3个仓库：1号仓库位于云南昆明；2号仓库位于云南贡山彝族自治州；3号仓库位于云南西双版纳。

1.1.2 草果样品

在2018年12月-2021年12月期间，分别从3个仓库中取样13次。采用高通量测序技术对所有的草果样品进行测序分析。

1.1.3 试验试剂

牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、可溶性淀粉、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸镁、蛋白胨、葡萄糖、马铃薯、Ezup柱式真菌基因组DNA提取试剂盒和Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物菌落的统计和分析

将每一个平板中的微生物多样性和数量进行统计，计算出所有采样地点中的菌落种类和平均菌落数，结果以每个立方中菌落的种类或者每个立方中菌落的数量进行统计，最后根据标本采集时间，分析生物丰富度与微生物多样性随着储藏时间的延长产生的动态变化[11-12]。

1.2.2 微生物的群落结构分析

利用分子生物学方法，对草果储藏仓库中的优势微生物种类进行鉴定和分析，初步对仓库中的微生物群落结构组成进行研究[13]。分别按照纯化菌落，进行DNA提取、PCR扩增、序列比对和物种的鉴定，最后对数据进行分析和鉴定[14]。

1.2.3 草果中生物活性酶的测定

1.2.3.1 中性蛋白酶活性

根据商业标准SB/T 10317—1999对草果中的中性蛋白酶活性进行测定，称取1 g草果样品，在40 ℃和pH为7.5的条件下制作待测酶液。待测溶液中含有酚基的氨基酸与福林试剂接触，产生蓝色反应，颜色的深浅与溶液中的氨基酸含量成正比。在波长680 nm处测定其吸光值，从而计算中性蛋白酶的活性[15]。

1.2.3.2 淀粉酶活性

根据国家标准GB/T 24401—2009中的方法，称取1 g草果样品，制作待测酶液，在70 ℃条件下水浴15 min，添加3,5-二硝基水杨酸，与淀粉溶液进行充分的化学反应，之后在波长540 nm处测定其吸光值，从而计算淀粉酶活性[16-17]。

1.2.3.3 果胶酶活性

根据轻工业行业标准标准QB 1502—1992中的方法，称取1 g草果样品，制作待测酶液，在50 ℃的条件下与果胶发生化学反应，并与DNS试剂作用，在波长540 nm处测定其吸光值，并计算果胶酶活力。

1.2.3.4 纤维素酶活性

根据轻工业行业标准标准QB 2583—2003中的方法，称取1 g草果样品，制作待测酶液，在37 ℃的条件下水浴，与葡萄糖溶液发生生化反应，之后与DNS试剂作用，并在波长540 nm处测定其吸光值，计算纤维素酶活力[18]。

2 结果与讨论

2.1 仓储环境空气中可培养微生物的采集

在2018-2021年期间分别对云南地区3个储藏草果的仓库中的微生物多样性进行分析，3个草果储藏仓库中微生物多样性见表1。对环境中的微生物进行13次调查分析，表1中的微生物数量均为13次测量的平均值。

表1 3个草果仓库中微生物多样性分析Table 1 Microbial diversity analysis in three warehouses of Amomum tsao-ko

对3个储藏草果的仓库中的微生物多样性进行检测。由表1可知，3号仓库的微生物总量明显多于其他两个仓库，3号仓库中的微生物总量分别约为1号仓库和2号仓库的11倍和13.7倍，另外，3号仓库细菌数量比真菌和放线菌数量相对多些。而1号和2号仓库真菌数量比细菌和放线菌数量多。3号仓库细菌数量多，为2781.2 CFU/m3，真菌为2671.2 CFU/m3，放线菌数量为2081.2 CFU/m3。这是由于3号仓库所处的地理位置潮湿，微生物更加容易繁殖。

2.2 仓储环境中可培养微生物多样性分析

由表1数据对3个仓库中微生物在Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数分析发现，3号仓库空气中微生物的Shannon-Wiener指数和Simpson指数明显高于其他两个仓库，分别达到了1.15，0.98，表明3号仓库中的物种丰富度更高。其次是1号仓库，Shannon-Wiener指数是1.10，Simpson指数是0.91。2号仓库的Shannon-Wiener指数、Simpson指数最低，分别是0.81，0.68。

2.3 仓储环境空气中可培养微生物动态变化

在2018年12月—2021年12月期间，对3个仓库中的微生物多样性进行分析，草果陈化时间越长，3个仓库中微生物表现得越稳定。由于仓库属于密封的情况，仓库中的微生物数量基本不受季节变化的影响，没有明显的演替现象，为草果的保存提供了稳定的微生物环境[19]。

由图1可知，3个仓库中微生物的丰富度和数量均存在一定程度的差异。从微生物的数量图来看，在1号仓库中，真菌的变化最为明显，其次是细菌，变化最小的是放线菌的数量。从整体来看，1号仓库中的真菌物种数量明显多于细菌和放线菌。1号仓库中的真菌、细菌和放线菌物种多样性差异不大。真菌和细菌的物种数量基本一致，但是多于放线菌。在2号仓库中，细菌和真菌的数量多于放线菌。但在2021年4月，检测的结果表明，放线菌的数量多于细菌和真菌，这是由于一批草果在4月份从外面进入仓库，仓库中的放线菌数量增多，随着时间的增长逐渐趋于平缓。在2020年12月以前，2号仓库中的放线菌微生物数量较低，而真菌和细菌的物种数量基本一致，并没有明显的变化。3号仓库中的微生物数量变化较大，不同的采样时间，微生物的多样性变化也很明显。针对3号仓库而言，不同的采样时间，微生物数量的差异较为明显。3号仓库中的微生物种类随着时间的变化并无明显差异，但有两次采样微生物中的细菌数量明显多于真菌和放线菌。

在3个不同的仓库中，1号仓库和2号仓库中的微生物数量或微生物种类差异都不明显。在3号仓库中，无论是微生物数量，还是微生物种类，都明显多于其他两个仓库。这是由于3号仓库位于云南西双版纳，具有高温高湿的气候条件，其仓库中微生物数量明显多于其他仓库。

2.4 草果中真菌多样性及群落结构分析结果

2.4.1 草果样本中的序列优化

采用宏基因组测序后，在18个样品中一共获得1437842条ITS的原始序列，每个样品中获得的原始序列范围大致为75012～82913条。经过数据拼接和数据库比对，每个样品中的有效序列为70149～80123条。样品中有效序列的有效利用率范围为93.18%～98.76%。

表2 3个草果储藏仓库中的真菌多样性分析Table 2 Analysis of fungal diversity in the three Amomum tsao-ko storage warehouses

2.4.2 3个草果仓库中真菌群落组成及变化

从3个草果仓库的不同样品中一共分离出4个门，20个纲，38个科，100个属和200个种，见表3。

表3 3个草果仓库真菌群落的组成Table 3 Composition of fungal community in the three Amomum tsao-ko warehouses

续 表

由表3可知，3个仓库中的微生物在门、纲、目、科4个级别上差异较小，在种的级别上差异最大。1号和3号仓库中，不同的样本之间物种多样性差异较大。2号仓库中的物种多样性差异较小。这可能是由于随机取样时，样品没有被彻底干燥[20]。

2.5 草果中的优势微生物群落与生物酶活性

由图2可知，3个仓库中生物酶活性变量基本一致。蛋白酶活性和果胶酶活性都随着草果的存放时间增长而逐渐降低，3个仓库中淀粉酶活性最强的是仓储18个月，纤维素酶活性最强的是仓储24个月。4种生物活性酶在3个储藏仓库中储藏相同的时间，活性酶的含量均不相同。从整体的结果来看，3号仓库中草果的生物活性酶要强于其他两个仓库中草果的生物活性酶，说明丰富微生物多样性对草果中的生物活性酶具有一定的影响。

3 小结

在自然的条件下，草果在仓库中储藏，其成分和生物酶活性会发生改变，而在草果的储藏过程中，微生物因子对草果本身的品质影响至关重要。一方面，微生物的活动使草果中大分子物质分解，从而容易被吸收和利用；另一方面，长时间储藏也会造成草果中的生物酶活性降低，从而影响草果中活性物质的生物活性功能。

研究结果表明，不同仓储草果的仓库中，微生物的多样性不同，储藏地一定程度上会对草果的活性物质产生影响。由于储藏物都为草果，所以3个草果储藏仓库中的微生物种类基本一致。