长江口咸淡水混合水域腐蚀性细菌的筛选及其对文物的腐蚀作用

叶天韵，黄 静，蒋雪中，赵 荦，翟 杨

(1． 华东师范大学生命科学学院，上海 200241； 2． 华东师范大学城市与区域科学学院，上海 200241； 3． 上海市文物保护研究中心，上海 200031)

0 引 言

随着海洋资源的进一步开发，人们开始关注海泥的腐蚀性以及材料在海泥环境中的使用性能[1]。海泥实际是饱和了海水的土壤，它是一种比较复杂的腐蚀环境。已有研究表明，海泥中存在如硫酸盐还原菌这样的菌，会对钢材造成严重的腐蚀[2]。除了深海咸水泥的腐蚀研究，淡水中也发现当金属表面存在微生物或堆积含有硫酸盐还原菌的泥沙时，由于硫氧化菌能氧化元素硫、硫代硫酸盐等产生代谢产物硫酸，在金属局部区域分泌出无机酸或者有机酸，从而加速了钢铁的腐蚀破坏[3-5]。目前，关于咸淡水混合水域的腐蚀性细菌研究鲜有报道。

微生物腐蚀(Microbiologically Influenced Corrosion，简称MIC)是指金属或非金属表面因微生物的生命活动而受到的腐蚀破坏[6]，MIC是生物电化学过程，比非生物腐蚀过程更为特殊和复杂[7]。海洋中的微生物接触到材料表面，分泌出胞外多糖与表面黏附的有机物、无机物发生反应，从而形成胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)，细菌与EPS一起附着于材料表面，形成生物膜，这层膜由各种细菌和微藻类以及它们的代谢产物组成，是发生微生物腐蚀的先决条件[8]。生物膜为微生物提供了一个微生态环境，生物膜内的固着细胞代谢活动旺盛，细胞数量比浮游细胞高出5～6个数量级[9]。在微生物的作用下，生物膜与材料界面的pH值、溶解氧、离子浓度与有机物含量等会发生明显改变，进而对材料的界面状态和腐蚀过程产生影响[10]。

长期以来，多数微生物腐蚀研究都集中于硫酸盐还原菌，目前有关硫酸盐还原菌致腐蚀作用的机理有：阴极去极化机理、浓差电池机理、局部电池机理、代谢产物机理、沉积物下的酸腐蚀机理、阳极区固定机理等[11-14]。但自然界中微生物种类繁多，近十几年的研究则表明细菌如铁细菌、锰细菌、产酸菌、产烷菌、假单胞菌等，甚至真菌类也能导致微生物腐蚀[15]。

文物作为一种载体，承载着人类古代文明的发展痕迹，具有很高的历史、艺术、科技、经济价值。随着文物保护事业的发展，文物保护需求的增加，包括生物学技术在内的很多自然科学领域的方法和技术逐渐被引用到文物保护中。从20世纪中叶开始，西方学者就运用生物学理论来评估各类文物的保存状况，并以评估结果为依据来完善文物保护措施[16-18]。目前也有报道显示，已经根据文物保护所用有机合成材料的耐微生物性，针对性地探索研究文物保护的各种分析技术[19]。

国内在文物保护微生物学方面，尤其是古代壁画和木质棺椁的微生物病害方面的研究也已取得阶段性进展[20-23]。发掘出水的海底文物面临着从低氧(或厌氧)环境转为有氧环境的变化，这一变化过程必然导致文物中细菌类群的变化以及细菌对文物分解或降解活动的加剧[24]。目前为止，针对文物细菌性病害的研究或调查主要集中在石质、壁画或岩画等无机质文物[25-28]，而对各类出水饱水木质文物的细菌性病害虽已引起重视[25，28-29]，但具体研究并不多见[30-31]。大量研究表明，木材细胞壁中主要含纤维素、半纤维素和木质素，饱水状态时细菌以木材中的上述成分为碳源而生存[32-34]。此外，微生物代谢产物中含有的某些酶也能够分解木质文物中的有机质[35]，因此饱水木质文物易受到微生物侵蚀。随着我国沿海越来越多木质沉船被发现[24，36]，由此面临的水下木质文物的生物损伤状况评估、后期的文物清理和保护等涉及细菌学问题也会越来越多。除了木质文物，还有很多被历史遗忘的陶器和瓷器也会经历被打捞的过程[37-38]。

在海洋环境下的瓷质文物，受到海洋中的可溶性盐、海洋微生物以及其他杂质的侵蚀，通过瓷器的缝隙以及孔洞发生腐蚀，而且会存在“正反馈”效应，即当陶瓷的釉面出现麻点式破损，坑点处容易寄生微生物，微生物排泄和尸体腐烂又形成了弱酸环境，进一步产生腐蚀。

因为出水文物在不同环境下的腐蚀情况不一，本研究主要内容为在沾有海泥的环境下，文物被微生物腐蚀的情况，着眼于海泥的微生物与文物腐蚀之间的联系，以应用于后期文物保护等相关方面。

1 材料和方法

1．1 样品来源

实验所用海泥取自中国长江口北港拦门沙水域，在长江口二号沉船附近，采样点经纬度为31°21′20″N，122°04′E，属于咸淡水混合水域[39]。

木头、陶器、瓷器等文物来源于长江口二号沉船水下勘探时所采集的碎片，对应长江口水下文物最主要的典型材质。

1．2 培养基配方

近年来，用于海水细菌筛选的培养基主要包括2216E培养基[40]、柠檬酸铁铵培养基[41]、Postage培养基[13]等(成分及用途见表1)，柠檬酸铁铵培养基和Postage培养基分别用于铁细菌和硫酸盐还原菌的定向培养，筛掉了其他可能的优势菌株。本研究在此基础上改进配方，选用富集培养基TSB培养基和BM2培养基，与2216E培养基类似，本研究所用的培养基对海水中的细菌也没有定向选择压力，而且无机盐含量更丰富，以期用于海洋优势菌，包括好氧菌和厌氧菌的富集培养。

表1 海水细菌筛选培养基Table 1 Seawater bacteria screening media

此外，本实验还用到LB液体培养基：NaCl 10 g/L，Yeast 5 g/L，Tryptone 10 g/L，灭菌陈海水溶解。

1．3 菌株的筛选与分离纯化

称取2 g海泥于20 mL TSB培养基或BM2培养基中，30 ℃摇床200 r/min富集培养24 h；从培养液中吸取100 μL，用灭菌陈海水按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀释，涂布LB固体平板，30 ℃培养24 h后，挑取单菌落划线观察并进行16S rDNA PCR。

1．4 生长曲线的绘制

根据16S rDNA的结果，按照1%接种量接种于30 mL LB液体培养基，220 r/min的摇床30 ℃培养，每隔2 h取样，用分光光度仪读取OD600，绘制生长曲线。

1．5 文物腐蚀实验

根据生长曲线，在菌液生长的对数生长期浸泡文物材料，220 r/min摇床下30 ℃培养7 d后在扫描电镜下观察结果。

2 结果和讨论

2．1 菌株的分离纯化

将TSB培养的菌液划线分离得到12株形态各异的单菌落(图1)，编号为S1～S12，将BM2培养的菌液划线分离得到6株形态各异的单菌落(图2)，编号为S13～S18。

图1 TSB培养基划线分离结果Fig.1 Results of the TSB media dash separation

图2 BM2培养基划线分离结果Fig.2 Results of the BM2 media dash separation

将以上菌株进行16S rDNA PCR(图3)，将成功扩增出1 500 bp条带的菌株(编号为S2，S3，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11，S12，S13～S18)进行测序，并在NCBI上进行比对，与GenBank中序列的相似性均达到了100%，因此可以确定到种，查找相关文献发现S8、S9(S13)、S10、S12均已报道出有腐蚀作用[42-52](表2)。

图3 16S rDNA PCR结果Fig.3 Results of 16S rDNA

表2 16S rDNA测序结果分析Table 2 Analysis of 16S rDNA sequencing results

2．2 菌株的生长曲线

根据文献报道，选择有腐蚀性能的4株菌：S8、S9、S10、S12以及两株没有腐蚀性能的菌：S2和S15接种于LB液体培养基，进行纯培养并绘制生长曲线(图4)，发现大部分菌在4～16 h处于生长旺盛的对数生长期(S8、S10、S2、S15)，其余菌在2～14 h达到对数生长期(S9、S12)，这为接下来的腐蚀实验奠定了基础。

图4 6株菌的生长曲线Fig.4 Growth curve of 6 strains

2．3 扫描电镜结果

因为出水文物在不同环境下的腐蚀情况不一，本次工作主要研究的是文物打捞出来后，在沾有海泥的自然空气环境下被微生物腐蚀的情况。根据生长曲线，在菌液生长的对数生长期浸泡文物材料样品(图5)，于220 r/min摇床30 ℃培养7 d后电镜观察结果。

图5 文物材料Fig.5 Cultural relic materials

根据文献报道，海洋中的微生物接触到材料表面，分泌胞外聚合物(EPS)，与细菌一起附着于材料表面，形成生物膜。这层膜主要由细菌及其代谢产物组成，是发生微生物腐蚀的先决条件[8]。硫酸盐还原菌作用于碳钢后能形成生物膜[51]。本次实验也观察到了在不同的文物材料表面也有类似的现象。

将文物材料浸泡于细菌菌液中7 d后，仅观察到大肠杆菌DH5α无生物膜形成，说明大肠杆菌对三种文物材料均无腐蚀作用。而文物在S9、S10、S12、S2、S15浸泡7 d后，在不同的文物材料表面形成了不同形态的生物膜，木头材料表面的生物膜疏松多孔(图6a)，瓷器材料表面的生物膜呈圆形但不均一(图6b)，陶器材料表面的生物膜致密呈簇状分布(图6c)。图6中白色方框表示在5 000倍电镜下观察的生物膜，白色箭头表示在相同位置18 000倍下观察的生物膜。

图6 文物材料在菌液中浸泡7 d后的电镜照片Fig.6 Electron microgcopic images of cultural relic materials soaked in bacteria solutions for 7 d

3 讨 论

海洋资源中存在丰富的细菌种群，不同位置的海泥有不同的优势菌种或特定菌种[54]。由于长期以来硫酸盐还原菌被认为是腐蚀的主要菌，但自然界中微生物种类繁多，近十几年的研究则表明细菌如铁细菌、锰细菌、产酸菌、产烷菌、假单胞菌等，甚至真菌类也能导致微生物腐蚀。本研究选用非定向的富集培养基，模拟海水环境(灭菌陈海水配制培养基)，以期用于海洋优势菌的富集培养。

本研究所采样的海泥中，分离纯化得到18株菌，芽孢杆菌所占的比例较大，为22．2%，经16S rDNA鉴定出4种已被报道有腐蚀性的细菌：哈夫尼希瓦氏菌(Shewanellahafniensis)、越南芽孢杆菌(Bacilluswiedmannii)、金橙微小杆菌(Exiguobacteriumaquaticum)和微小杆菌(Exiguobacteriumindicum)。但这些微生物是否腐蚀木头、陶器、瓷器这些文物材料是未知的，所以本研究做了相关实验证明是否对于文物材料也有腐蚀作用。在本次文物材料浸泡实验中，均产生腐蚀后的代谢产物——生物膜，而生物膜的形成是微生物腐蚀发生的关键步骤和先决条件。这三株菌本身被报道是腐蚀性菌，再与文物材料作用又能产生生物膜，初步可认为发生了腐蚀作用。此外，还有2株未被报道是腐蚀性细菌的萘醌对希瓦氏菌和嗜水气单胞菌也在文物材料表面产生了生物膜，提示了这两株菌可能参与了腐蚀过程，它们的具体机制还值得进一步探究。

材料在海水中，腐蚀过程包括4个阶段[42]：形成条件层、微生物附着形成生物膜、软体宏观污损和硬体宏观污损。微生物诱导腐蚀的本质是生物膜的存在及其与材料基体间的相互作用[7]，所以主流观点都认可生物膜是微生物腐蚀的先决条件。具体腐蚀机制须根据生物膜下的微生物代谢产物与材料的实际化学反应来阐释，后续将进一步研究。

腐蚀作用是多种介质一起参与形成的复杂反应，除了单个细菌的影响外，多种细菌相互作用也能加速腐蚀过程[7]。本研究只关注了单个细菌对文物材料的腐蚀作用，对于多种细菌间的相互作用还有待进一步的探究。

已有文献报道[37-38]，从海水打捞出来的陶瓷文物和耐蚀材料不锈钢均可见微生物腐蚀。这提示从海底打捞的文物材料长期处在海水环境下都会发生腐蚀过程。本研究只将文物材料置于菌液中培养7 d，针对不同文物材料腐蚀所需的时间以及腐蚀所需的菌浓度还有研究的空间。

4 结 论

探究了长江口咸淡水混合水域的海泥中的优势菌株为芽孢杆菌，并细分出4株腐蚀性细菌和2株未被报道为腐蚀性细菌但具有腐蚀潜力的细菌，区别于以往微生物腐蚀研究都集中于硫酸盐还原菌这一类菌。本研究发现了更多的腐蚀性细菌，揭示了海岸带咸淡水混合水域微生物的丰富性。

其中，将4株腐蚀性细菌作用于对瓷质、陶质和木质文物材料，观察到材料表面生成与微生物腐蚀密切相关的生物膜，从而实验证明哈夫尼希瓦氏菌、越南芽孢杆菌、金橙微小杆菌和微小杆菌对于瓷质、陶质和木质材料的腐蚀作用。

另外2株未被报道为腐蚀性细菌但具有腐蚀潜力的细菌：萘醌对希瓦氏菌和嗜水气单胞菌，它们也能在文物材料表面生成生物膜，初步证明这两株菌也具有腐蚀效果。

文物作为人类智慧的优秀结晶和遗存，文物保护不仅是对历史的承诺，也是对后人的启迪。利用现代生物学技术研究文物腐蚀，可以给文物保护提供新的思路。