动物神经性疾病相关神经递质检测技术进展

罗荪琳 ， 范瑞祺， ， 张婉君， ， 贾 栗 ， 苑晓燕 ， 陈义强

(1.中国农业大学动物科学技术学院 动物营养学国家重点实验室 ， 北京 海淀 100193 ；2.中国人民解放军疾病预防控制中心 ， 北京 丰台 100171)

神经递质是机体中神经信号传递的内源性化学物质，在神经系统中发挥重要功能。动物神经性疾病(如癫痫)的发生往往伴随着神经递质含量的变化，并且神经系统相关的药物开发(如麻醉剂)与外源性化合物(如有机磷农药)对动物的神经毒性研究中通常以神经递质的含量变化作为检测指标，因此在兽医领域神经递质的定量测定是十分重要的。

根据神经递质的化学本质，可将其分为单胺类神经递质、胆碱类神经递质、氨基酸类神经递质和肽类神经递质等(表1)。不同种类神经递质化学特性不同，适用的检测方法也不尽相同。神经递质检测常需要分离技术和检测方法联用测定，前者常用方法主要是色谱法和毛细管电泳法，后者主要仪器包括质谱检测器、荧光检测器、电化学检测器和紫外可见检测器等[1]。本文总结了近年来与动物神经性疾病发生密切相关的四类神经递质(单胺类神经递质、胆碱类神经递质、氨基酸类神经递质和肽类神经递质)的检测技术进展，以期为兽医神经性疾病临床诊疗和药物开发提供一定帮助。

表1 神经递质分类

1 单胺类神经递质

单胺类神经递质包括儿茶酚胺和吲哚胺类，前者主要包含多巴胺(Dopamine,DA)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)和肾上腺素(Epinephrine,E)，后者主要包括5-羟色胺(Serotonin,5-HT)和5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)，参与记忆、睡眠、感觉传递等生理过程[2-3]以及兽药噻拉嗪等的作用途径[4]。常见单胺类神经递质的分子结构式见图1。

图1 常见单胺类神经递质分子式

液相色谱法是测定单胺类神经递质的最常用方法，在使用反相液相色谱时，由于单胺类神经递质具有强极性，在色谱柱上保留时间短，需要通过衍生化处理改善单胺类神经递质的色谱保留行为[5]，如以苯甲酰氯[6]作为衍生化试剂的液相色谱串联质谱方法检测单胺类神经递质。亲水相互作用色谱可替代反相液相色谱，Konieczna等[7]建立了分散液-液微萃取的液相色谱-亲水相互作用色谱-质谱方法测定单胺神经递质及其各自的前体和代谢物。为适应不同样品中神经递质的检测，Li等[8]建立了苯硼酸辅助的双功能固相萃取结合液相色谱串联质谱方法实现尿中单胺类神经递质的临床常规检测。Fuertig等[9]加入氘代内标，无需衍生即可通过液相色谱串联质谱定量分析包括DA、5-HT等在内的11种物质。尽管许多研究使用高效液相色谱与质谱联用技术测定单胺类神经递质含量，但试验发现与高效液相色谱联用的检测器不同时，检测效果存在差异。一项研究分别使用高效液相色谱与紫外、荧光和质谱检测器联用，测定小鼠不同脑组织中单胺类神经递质水平，结果显示使用荧光检测器的检测结果更好，定量限低且基质效应弱[10]。这说明不同样品中神经递质的最优检测方法不同，一种检测方法的建立无法适用于所有检测样品，需要针对不同物种、不同样品基质等条件分别建立合适的检测方法。另外，微透析活体采样技术也广泛用于体内神经递质含量的实时监测，但微透析取样后的样品量少，如何能使用少量样品准确定量神经递质含量也是一个挑战。Carreo等[11]建立了一种用于微透析样品中DA、5-HT等定量分析的液相色谱串联质谱方法，该方法精密度和检测限均能满足测定要求。

2 胆碱类神经递质

乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)是最主要的胆碱类神经递质，由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶的催化作用下合成，参与记忆、学习和认知、运动、摄食、压力等生理过程[12]，与动物热应激、麻醉药物作用发挥等[13-14]有重要联系。ACh的分子结构式见图2。

图2 乙酰胆碱分子式

ACh同样可用色谱法进行测定，如液相色谱串联质谱方法对血浆[15]以及大鼠不同脑区[16]ACh含量进行测定。色谱法测定ACh的难点在于内源性化合物γ-丁酰甜菜碱与ACh结构相似，容易干扰ACh的测定。Lamy等[17]建立了一种高灵敏度亲水相互作用色谱-质谱方法，可有效分离ACh与γ-丁酰甜菜碱。

此外，还可使用传感器法[18]和荧光探针[19]测定ACh。传感器检测技术研究不断寻求新的材料构建生物传感器，Chauhan等[20]建立了将乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶固定在改性氟掺杂氧化锡上构成的生物传感器，用于测定血清样品中的ACh水平，该方法具有较高的灵敏度和较低的检测限。近年来单独检测ACh的方法建立较少，大多建立的新方法是用于ACh与其他种类神经递质共同检测，如液相色谱串联质谱法同时测定啮齿动物脑脊液中[21]和大鼠脑中[22]ACh与多种氨基酸类神经递质。

3 氨基酸类神经递质

氨基酸类神经递质种类较多，包括谷氨酸(Glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid,GABA)、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)、甘氨酸(Glycine,Gly)等，此类神经递质参与调节情绪、感知传递等生理过程[2]，与动物癫痫[23]、肝性脑病[24]等疾病相关[25-27]。常见氨基酸类神经递质的分子结构式见图3。

图3 常见氨基酸类神经递质分子式

氨基酸测定即可直接使用氨基酸分析仪进行样本中游离氨基酸批量测定[28]，一般多用高效液相色谱法检测氨基酸类神经递质,但氨基酸分子结构小,且大多没有光学性质,因此一般先将其衍生化,再利用色谱法进行分析，即柱前衍生[29]。常用的衍生剂有邻苯二甲醛[29]、异硫氰酸苯酯[30]等。测定氨基酸类神经递质时色谱常与荧光检测器联用，Cui等[31]开发了一种高效液相色谱-荧光法测定抑郁大鼠脑组织7种氨基酸类神经递质含量；Li等[32]通过高效液相色谱-荧光检测器结合邻苯二甲醛衍生定量检测小鼠脑缺血后大脑皮层和血浆中的18种氨基酸；Huang等[33]建立了高效液相色谱-荧光法同时测定糖尿病大鼠皮质和海马中与糖尿病脑病发病机制相关的9种神经递质。许多文献通过液质联用测定氨基酸类神经递质。Yan等[34]通过高效液相色谱-串联质谱法测定大鼠脑中的5种神经递质，用于研究刺槐水提物对失眠大鼠模型的催眠作用。使用4′-碳酰氯玫瑰胺作为衍生试剂，基于原位超声辅助衍生化分散液-液微萃取结合高效液相色谱-串联质谱方法，可分析阿尔茨海默病大鼠尿液中的氨基酸和单胺类神经递质及其代谢物[35]。液相色谱法串联质谱结合微透析可实现对大鼠突触间隙中氨基酸类神经递质水平的同步检测[36]。毛细管电泳也适用于手性氨基酸拆分和复杂样品中的氨基酸分析[37]，结合激光诱导荧光检测器，在邻苯二甲醛衍生下用荧光硫醇快速标记氨基酸神经递质可进行高通量分析[38]。

4 肽类神经递质

肽类神经递质包括谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、内源性阿片肽(Endogenous opioid peptides,EOP)和脑啡肽(Enkephalin,ENK)等，参与睡眠、情绪调节、学习记忆等生理过程，与犬脊髓损伤[39]等动物疾病发生有关。常见肽类神经递质的分子结构式见图4。

图4 常见肽类神经递质分子式

早期的肽类物质含量测定多采用免疫亲和法，随着联用技术的发展，液相色谱结合微透析法检测肽类的方法逐渐丰富，近年来这些方法还在不断改进，Wilson等[40]使用同位素内标建立毛细管液相色谱-串联质谱方法对大鼠海马中神经肽进行定量分析；Al-Hasani等[41]开发了一种光遗传性微透析探针结合液相色谱串联质谱方法用于测定阿片肽等神经递质含量。此外，肽类神经递质的活体原位实时监测可采用电化学法(如快速扫描循环伏安法[42])进行。

总结与展望

神经递质是神经系统的信使，将神经中枢的信号传至各个组织和器官，在动物机体内发挥着重要作用。近年来，随着质谱技术的发展，在神经递质测定中色谱与质谱联用方法不断改进，尤其是液相色谱串联质谱法。活体采样微透析法、电化学法以及各种传感器技术都有不同程度的发展，各种小分子物质被尝试用作生物探头，如纳米材料、荧光材料。许多研究证明，神经性病变往往是多种神经递质浓度改变的综合结果，因此多神经递质的同步测定方法亟需建立。为满足兽医领域神经递质定量分析需求，未来亟需发展活体原位实时测定的高灵敏度、高通量多神经递质同步测定方法。