铁皮石斛组织培养研究

蔡正旺

（安康学院，a.电子与信息工程学院；b.现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000）

铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）为兰科石斛兰属多年生附生草本，喜在半阴半阳的环境中生长，主要分布在中国的南部和西南部［1］，具有较高的药用价值和经济价值，是中国传统名贵中药材，医学界称其为“药界大熊猫”。铁皮石斛自然繁殖力极低［2］，加之人为过度采挖和生境破坏，野生铁皮石斛已濒临绝迹［3］。

以铁皮石斛种子为材料资源短缺，没有足够的材料用于铁皮石斛的工厂化生产；以原球茎为外植体增殖率比较低，用于规模化生产成本比较高；以茎尖为外植体，大多数是依附于带芽茎段，单独以茎尖为外植体的成活率低；以叶片为外植体，叶片分化程度比较高，培养成完整植株的能力比较低，也不适合工厂化生产。国内学者对铁皮石斛的外植体选择开展了较多研究，以铁皮石斛的种子［4］、原球茎［5］、茎尖［6］、幼叶［7］、无菌苗茎段［8，9］等为材料通过增殖、分化、生根培养方式获得了再生苗或完整植株。

也有文献报道铁皮石斛组织培养中的生长调节剂选择［10-14］、炼苗与栽培管理等［15-17］。为促进秦巴地区产业发展和乡村振兴，探究铁皮石斛的可持续利用，在当地开展铁皮石斛快速繁殖技术的研究。以铁皮石斛茎段为外植体，来源广、操作简单，探索适合于规模化生产途径，助力铁皮石斛产业链的发展。用不同激素组合的培养基进行培养，诱导腋芽、丛生芽的增殖，筛选出最优诱导腋芽和丛生芽增殖的培养基、最适合栽培基质，为铁皮石斛建立快速繁殖体系提供技术支撑，并选取不同基质对铁皮石斛进行移栽，筛选铁皮石斛生长的最适基质。解决铁皮石斛无菌苗移栽驯化成活率低、种苗品质差、培养周期长的问题，为铁皮石斛在秦巴地区实现产业化生产提供参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛盆栽苗来源于云南省德宏芒市繁锦花市。

1.2 方法

1.2.1 外植体的灭菌 将铁皮石斛苗的枝条整枝剪下，去掉叶片，用洗洁精水浸泡15 min 左右，自来水冲洗干净后，用刀片切成2~3 cm 长的茎段，75%乙醇灭菌30 s，无菌水冲洗3 次，再用0.1%的氯化汞灭菌10 min 左右，并不断摇晃烧杯使其灭菌充分，最后将氯化汞倒出后用无菌水冲洗5~6 次备用。

1.2.2 不同生长调节剂组合对铁皮石斛腋芽诱导的影响 将灭菌的铁皮石斛茎段接种在添加不同浓度6-BA 和NAA 的6 种MS 培养基上（表1），每个处理接种12 瓶，每瓶接种3~4 个外植体，每个处理重复3次，培养温度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d，30 d 后统计腋芽诱导率，观察腋芽的生长情况，筛选出诱导腋芽的最佳生长调节剂配比。计算公式如下。

表1 铁皮石斛腋芽诱导培养基生长调节剂组合（单位：mg/L）

1.2.3 不同浓度的香蕉泥对腋芽诱导的影响 在培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 中加入不同浓度的香蕉泥，香蕉泥浓度分别为0、50、100、150、200 g/L。将灭菌的铁皮石斛茎段分别接种在含不同浓度香蕉泥的培养基上，每种接种12 瓶，每瓶接种3~4 个外植体，3 次重复，培养温度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d，30 d 后统计腋芽诱导率，比较5 种培养基对铁皮石斛腋芽诱导的影响，筛选出适合铁皮石斛腋芽诱导的香蕉泥浓度。

1.2.4 铁皮石斛芽增殖培养 将诱导出的腋芽切下，转接到添加有不同浓度6-BA 和NAA 的培养基上（表2），每处理接种12 瓶，每瓶接种3~4 个腋芽，3次重复，培养温度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d，30 d 后统计腋芽增殖系数及丛生芽的生长情况，筛选出芽增殖最佳培养基。增殖系数计算公式如下。

表2 铁皮石斛芽增殖培养基生长调节剂组合（单位：mg/L）

1.2.5 铁皮石斛组培苗移栽驯化 当铁皮石斛组培苗达4 cm 以上，且有6~8 片叶和3~4 条3 cm 以上的根时，取出组培苗并将组培苗根上的培养基清洗干净，晾至根发白，然后移栽到装有不同基质的花盆中，移栽的基质体积配比如表3 所示。每盆移栽3~4株幼苗，每种基质移栽10 盆，培养温度（25±2）℃，30 d 后，统计茎的平均生长量及新增的芽数。计算公式如下。

表3 铁皮石斛幼苗移栽驯化基质组合（单位：份）

2 结果与分析

2.1 不同生长调节剂组合对腋芽诱导的影响

不同生长调节剂组合对铁皮石斛腋芽诱导的影响见表4。从表4 可以看出，以MS 为基本培养基，不同生长调节剂组合对铁皮石斛腋芽的诱导有明显的差异。其中2 号培养基的腋芽诱导率最高，为76.5%，腋芽饱满、浓绿、健壮，6 号培养基的腋芽诱导率为71.4%，腋芽叶色浓绿、较为粗壮。其他几种培养基的腋芽诱导率较低，且有部分外植体的腋芽较瘦弱、颜色发黄、生长速度缓慢，有少量腋芽在后期褐化死去。综合来看，2、6 号培养基均适合铁皮石斛腋芽的诱导。

表4 不同生长调节剂组合对铁皮石斛腋芽诱导的影响

2.2 不同浓度香蕉泥对腋芽诱导的影响

通过对加入不同浓度香蕉泥的培养基比较发现，培养基中加入香蕉泥比不加入香蕉泥的腋芽诱导率要高（表5），其中培养基中加入100 g/L或150 g/L香蕉泥的铁皮石斛腋芽的长势好、新芽健壮、芽叶浓绿，腋芽基部有少数根生成。试验中，随着香蕉泥的浓度增大，铁皮石斛的腋芽诱导率增加，香蕉泥的浓度达到200 g/L 时，腋芽的诱导率不再增加，更高浓度的香蕉泥对腋芽诱导率的增加没有效果。考虑经济成本，选择培养基中加入100 g/L 的香蕉泥。综上所述，最适合铁皮石斛腋芽诱导的培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100 g/L 香蕉泥。

表5 不同浓度香蕉泥对铁皮石斛腋芽诱导的影响

2.3 不同生长调节剂组合对芽增殖的影响

将诱导出的铁皮石斛腋芽切下接种在5 种增殖培养基上，10 d 后，发现切口处长出少量丛生芽，芽浓绿、健壮，部分芽基部出现数条细小的根（图1a）。25 d 后，腋芽长高，芽上有6~7 片新叶，叶色浓绿（图1b），60 d 后幼苗已长至10 cm 左右，基部分化出数条健壮的根（图1c）。从表6 可以看出，1—3 号培养基中，NAA 浓度不变时，随着6-BA 浓度增加铁皮石斛增殖系数降低。4 号培养基的6-BA 和NAA 浓度都较高，其丛生芽的增殖率并不高，且丛生芽较瘦弱，可能是高浓度的生长调节剂抑制了丛生芽的生成，当6-BA 的浓度为2.0 mg/L、NAA 的浓度为0.5 mg/L 时，铁皮石斛的增殖系数最高，长势最好。铁皮石斛芽增殖最适培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。6-BA 和NAA 的生长调节剂组合，不仅能用于铁皮石斛腋芽、丛生芽的增殖，而且也有利于根的形成。

图1 铁皮石斛组培苗长势

表6 不同生长调节剂组合对铁皮石斛芽增殖的影响

2.4 不同移栽基质对铁皮石斛组培苗移栽驯化的影响

当铁皮石斛组培苗达到移栽要求时，将组培苗根上的培养基洗干净，晾至根发白（图2），再移栽到装有不同基质的花盆中。从表7 可以看出，铁皮石斛的5 种移栽基质，单一基质和复合基质的幼苗成活率均为100%。单一基质锯末和混合基质松树皮+锯末（7∶3），平均有6 个新芽萌发，且新芽色浓绿、茎粗壮，老茎加粗较为明显；而混合基质珍珠岩+松树皮（1∶1）和锯末+碎砖末（9∶1），都有5 个新芽萌发，新芽叶色绿、茎较壮，茎有伸长和加粗；单一基质松树皮，只有2 个新芽萌发，茎生长较缓慢。从茎平均生长量分析，单一基质锯末中的茎平均生长量为2.6 cm，是5 种栽培基质茎伸长最多的；混合基质松树皮+锯末（7∶3）的茎生长2.5 cm，这2 种移栽基质茎段生长明显。混合基质珍珠岩+松树皮（1∶1）和锯末+碎砖块（9∶1），虽然平均新发芽数较多，但其茎的伸长较小，因此，最适合铁皮石斛组培苗移栽驯化的基质是单一基质锯末和混合基质松树皮+锯末（7∶3）（表7、图3）。

图2 铁皮石斛组培苗移栽前晒苗

图3 铁皮石斛组培苗移栽驯化

表7 不同栽培基质对铁皮石斛组培苗移栽训化的影响

3 小结与讨论

铁皮石斛腋芽的诱导和丛生芽的增殖与生长调节剂、天然添加物、培养基的基本成分等有关。植物生长调节剂是植物组织培养不可或缺的物质，用量虽少但在植物组织培养过程中非常重要，而合适的生长调节剂组合又是成功培养铁皮石斛的关键。马玉申等［18］在铁皮石斛带节茎段的组培快繁体系研究中发现，当6-BA 为2.0 mg/L、NAA 0.2~0.6 mg/L 诱导效果均较好，其中NAA 为0.2 mg/L 时效果最好。罗焕明等［19］认为，在铁皮石斛组织培养中，香蕉泥的作用是使组培苗根系发达苗粗壮且整齐。本试验结果表明，在铁皮石斛腋芽诱导中，当6-BA 浓度为1.0 mg/L，NAA 浓度为0.5 mg/L 时效果最好。100 g/L的香蕉泥有助于铁皮石斛的腋芽生长健壮，可使组培苗整齐、根系发达、叶色浓绿。在铁皮石斛丛生芽增殖培养中，当6-BA、NAA 的浓度分别为2.0、0.5 mg/L 时，铁皮石斛芽的增殖率最高，丛生芽数最多，长势最好，增殖的新芽最健壮。潘梅等［13］认为在2.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA 的培养基上铁皮石斛芽增殖效果最好。铁皮石斛移栽驯化结果表明，铁皮石斛在单一基质锯末和复配基质松树皮+锯末（7∶3）中移栽后生长状况好，新发枝条多，更有利于铁皮石斛的工厂化生产。