不同冷冻保护剂在血管深低温保存中的研究进展

谭丽，王成，陈世玖

(遵义医科大学第五附属(珠海)医院整形手外科,广东 珠海 519100)

血管参与构成人体循环系统，作为众多组织、器官运输能量的载体，起到再植后向组织、器官供送血液的作用，血管超低温保存技术可增加器官、断肢、断指移植机会。在实验和临床工作的基础上，2011—2013年首次验证了深低温保存的动静脉移植物用于临床[1]。人体血管超低温保存技术是旁路手术或外周血管重建的重要工具，因此需储备大量血管供临床所需[2]。最初研究冷冻保存的方法主要为细胞深低温保存技术，对于同种细胞类型，存在一组最佳保存的条件；而组织是复杂的多细胞系统，其含有不同类型的细胞，具有不同的超低温保存要求。在冷冻保存过程中，组织内的所有细胞类型将受到相同的冷却和解冻参数，并且组织的结构及功能更为复杂，故确保血管结构的完整和功能的保留是决定超低温保存成功的关键[3]。理想的超低温保存血管应保持与新鲜血管相当的功能特性，超低温保存技术是最常见的保存方法，在超低温保存中会引起细胞凋亡及组织结构损害，为了改善冷冻和解冻过程中的细胞损伤，冷冻保护剂(cryoprotectant，CPA)在超低温保存中被应用[4]。但常见CPA具有一定的毒性作用，阻碍超低温保存同种异体血管的临床发展[5]。现通过血管超低温保存的损伤机制、CPA在血管超低温保存中的应用及对血管超低温保存技术的展望总结当前血管超低温保存技术的现况，为后续制订更标准的血管及器官超低温保存方案提供一定的理论依据。

1 血管超低温保存的损伤机制

19世纪和20世纪早期，生物学家对冬季耐寒和冰霜抵抗研究后产生了一些最早的冷冻保存概念，在没有添加任何CPA的生物样品中，冻结的细胞和组织发生了深低温保存诱发的损伤，例如细胞内冰晶形成和巨大渗透差。血管由内膜层、中膜层、外膜层组成，三层膜分界不清，内膜层由血管内皮细胞组成，向外延续至肌层，中膜层由平滑肌细胞及纤维细胞构成，向外延续至浆膜层。血管是由多种细胞及纤维组织、基膜构成的环状结构，超低温保存均会造成这两种结构的损伤。

1.1血管细胞损伤 构成血管组织的细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、纤维细胞等，在超低温保存过程中随着冷却的进行，细胞在超低温保存液中失去渗透平衡。从常温至-196 ℃，细胞及细胞外基质发生一系列变化；在冷却温度 -5 ℃时，细胞外基质开始冷冻，但细胞质仍未冻结；在-5～-10 ℃，细胞外冰晶形成增多导致基质中溶质浓度增加，造成严重细胞脱水和收缩；在-10～-15 ℃，细胞外冰晶形成进一步增多，细胞与冰和细胞与细胞接触增加，导致细胞损伤。事实上，在-15～-60 ℃，细胞内液完成水到冰的过渡，细胞内冻结增多；细胞外冰晶生长较大，冰晶氢键通过细胞膜实现细胞内冻结，以此来均衡细胞内外渗透压。细胞内冻结被认为是冷冻保存诱导的细胞损伤的主要因素[6]。因此，在-15～-60 ℃，必须实现两次冷冻、解冻，这是细胞成活的重大挑战[7]。

1.2血管细胞外成分损伤 血管组织除了由各类细胞构成外还有纤维组织、基膜等。血管属圆筒状结构，在超低温保存过程中体积膨胀和组织内温度分布不均引起生物样品内部温度分布不均，温差较大，在组织内部产生较大的热应力，尤其是在冻结过程中由于体积膨胀引起的热应力，使超低温保存的组织遭受机械损伤。1994年Hunt等[8]发现血管超低温保存中组织的断裂，徐红艳等[9]发现，低温保存血管组织时,管壁上出现裂纹甚至发生断裂，并提出其与降温速率有关。采用阶梯式慢速复温可以减少血管超低温保存中的机械应力损伤。此外，在超低温保存中加入CPA使得血管冻结过程未冻结水分额明显增大，避免了热应力对血管的机械损伤。胥义等[10]的实验亦证明，降温速率和低温保护剂浓度会对血管热应力产生影响。添加高浓度的CPA时，血管超低温保存中的热应力显著减小。

2 CPA在血管超低温保存中的应用

为避免超低温保存中细胞内外冰晶形成及冻结后的机械应力损伤，研究人员开始向超低温保存液中添加化学品，它们被称为“CPA”，并进行了CPA的初步尝试。CPA是一种广泛的术语，可以用于描述任何外部添加剂，当在冷冻之前添加时，可保护细胞免受各种超低温保存损伤并保留细胞活力。根据能否通过细胞膜将CPA分为渗透性和非渗透性，常见的渗透性CPA有二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甘油、甲酰胺和丙二醇等；非渗透性CPA有糖类(如蔗糖、海藻糖、葡聚糖、乳糖和D-甘露醇)和高分子聚合物类[如聚乙二醇和羟乙基淀粉(hetastarch,HES)]。它们的冷冻保护作用包括降低溶质的浓度以及在脱水和复温阶段增加膜稳定性[11]。在超低温保存中使用低浓度CPA以保护血管同种异体移植物为经典的超低温保存方式——超低温慢速冷冻技术；虽然低浓度CPA可以减少冰晶的形成，但不能形成玻璃化状态。然而，玻璃化形成需要较高浓度的CPA，常用的CPA(如DSMO)具有一定的毒性，故冷冻保护溶液的毒性去除需要更多的研究，为超低温保存组织库制订更为标准的玻璃化保存方案[12]。

2.1渗透性CPA的应用 1949年，由于错误标记冻结了甘油、鸡蛋液及水，发现甘油具有冷冻保护的作用[13]；随后其被广泛应用于细胞与组织超低温保存。早在1976年，Ramazzotto和Engstrom[14]将灌注5%、10%及15%甘油哺乳动物心脏放入液氮中进行超低温保存，并且用组织学、组织化学和电子显微镜技术检查心室组织的组织学损伤、糖原耗竭和酶位点，发现甘油在心脏深低温保存中具有保护作用。有报道显示，使用血管吻合术移植超低温保存的大鼠卵巢中可产生正常卵子，并发现在冷冻大鼠卵巢中有一部分血管功能保存良好[15]。甘油由于具有脂溶性可进入细胞内，调节细胞内外渗透压，从而减轻血管在超低温保存中的损伤。

甘油的运用虽广泛，但不能溶于水，不能用作保存所有细胞类型的通用溶质。为了克服这一问题，Lovelock[16]开始探索其他低分子量的化合物，发现DMSO对活细胞的渗透性比甘油更高，观察到DMSO渗透细胞(牛和人红细胞)的速度比甘油更快，且需要量低，冻结损伤小。1987年，O′Brien等[17]引入了使用DMSO作为CPA的心血管组织的长期储存的冷冻保存，并证实了DMSO对主动脉的保护效果，新鲜与冷冻保存的同种异体移植物的活力相近。Westphal等[18]用DMSO灌注和浸泡动物卵巢进行超低温保存，发现低温保护水平可达90%～100%，当使用相同的方法超低温保存人类卵巢时，在组织水平上观察到其保护作用超过95%；此外，血管内皮没有明显的形态学损伤。

2.1.1渗透性CPA的毒性 2018年，Finger和Bischof[19]提出玻璃化保存是器官超低温保存的一个新技术，可以替代常规超低温保存。玻璃化保存是通过调节CPA浓度和冷却速率，使液体物质快速冷却的过程，其过程基本上可以预防细胞内外冰晶形成，将冷却的液体转化为玻璃化状态，更好地保存细胞外基质和细胞活力。玻璃化保存技术需高浓度的CPA，故CPA的毒性作用被关注。作为最广泛使用的CPA，DMSO本身具有的劣势限制了其临床应用。首先，DMSO是具有内在毒性的有机溶剂。据报道，DMSO与细胞代谢和发育的功能障碍有关，引起酶的功能受损和细胞凋亡[20]；此外，DMSO可强烈促进干细胞不受控制的分化[21]。在临床细胞移植中，DMSO被认为是引起患者各种不良反应的原因，包括免疫、神经系统并发症和肾肝功能的影响等[22]。其次，为了使DMSO引起的不利影响最小化，需要较长时间的洗涤步骤，因为DMSO的跨膜扩散速率明显低于水通道蛋白的运输速率，在DMSO去除期间，巨大渗透压差也会导致细胞损伤。故如何降低超低温保存中CPA的毒性有待进一步研究。

2.1.2低毒渗透性CPA DMSO具有一定毒性作用，难以应用于临床，因此需要更为标准的CPA来替代DMSO，天然生物相容性渗透性CPA同样可以通过降低渗透压来保护细胞，防止细胞免受渗透损伤的影响，而不会影响重要的细胞功能。此外，大多数渗透剂是亲水分子，脯氨酸、甘氨酸和牛磺酸是3种类型生物相容性渗透性CPA的代表[23]，天然存在于哺乳动物的组织、肌肉和心脏中。Yang 等[24]探讨了3种生物相容性渗透性CPA的作用，发现脯氨酸预防哺乳动物细胞渗透损伤及抑制细胞内外冰晶形成的能力较强。为寻找高效和生物相容性的CPA提供了一种新途径。

2.2非渗透性CPA的应用 一些糖类(蔗糖，海藻糖和棉籽糖)以及高分子聚合物类(HES)已用于哺乳动物组织的玻璃化保存[25]。糖类在超低温保存中的作用为：①增加玻璃化溶液的黏度，并提高玻璃化溶液所需的玻璃化转变温度，减少细胞外冰晶形成导致的细胞物理损伤[26]；②在冷冻期间通过氢键稳定细胞膜，从而保护细胞[27]；③在冷却过程中，糖类保护组织和细胞免受降温和CPA去除期间的渗透冲击引起的损伤；在变暖期间，细胞外CPA浓度迅速降低，导致渗透性不均衡引起细胞过度膨胀，最终导致细胞裂解[28]；④辅助渗透CPA形成玻璃化，糖类有助于增加玻璃化溶质的黏度和张力，允许使用较低浓度的渗透CPA，从而降低渗透性CPA的细胞毒性和渗透休克效应[28]；⑤糖类还可以帮助渗透性CPA提高细胞外溶液的玻璃化状态，大大减少细胞外冰晶的形成。

2.2.1糖类 非渗透性CPA通过在低温下保留更多的液态水来稳定细胞体积，从而降低外部电解质浓度，减少渗透损伤，如单糖和二糖均广泛用于细胞系的低温保存。但与单糖相比，蔗糖和海藻糖是所有二糖中最有效的CPA。在血管超低温保存中，糖类常作为辅助保护剂与渗透性CPA一起发挥保护作用。1992年，Müller-Schweinitzer 和Ellis[29]将蔗糖和DMSO一起用于超低温保存血管并探索其功能活性，证实了渗透和非渗透性的保护作用是协同的，即通过DMSO和蔗糖的组合作用，可实现对冷冻血管平滑肌的保护。在糖类中，因为蔗糖成本低，所以主要用于哺乳动物组织的玻璃化。Arutyunyan等[30]的研究发现，最终浓度为0.2 mol/L蔗糖会提高甘油的效率；10%甘油和蔗糖的组合保存效果与DMSO和乙二醇与蔗糖的组合相当，故蔗糖对脂膜的动态特性会促进甘油进入细胞。渗透性和非渗透性CPA均直接在细胞膜水平上发挥作用，所以它们的保护行为是协同作用。

此外，研究表明中药及复方可以改善血管内皮细胞氧化应激损伤，一些中药提取物值得被关注，如枸杞多糖、附子多糖等；这些中药提取物作为非渗透性CPA具有低毒性的特点，颜贝等[31]将枸杞多糖应用于精子的超低温保存保护，发现其可降低精子活性氧水平，保护线粒体结构和功能，从而改善解冻后精子质量。附子多糖是我国中药附子中的提取物，其可以抑制血管钙化、延缓心肌衰老及保护心肌细胞等。研究发现，附子多糖具有抗氧化应激、保护平滑肌细胞及内皮细胞的功能，从而保护血管[32]，由此可将附子多糖引入血管的深低温保护研究中，但目前尚缺乏整体且系统的实验研究。

2.2.2高分子聚合物类 一些高分子聚合物也被用于血管冷冻保护，如HES，Körber和Scheiwe[33]的研究表明,HES通过从细胞膜外部吸收水分子并将它们保持在玻璃化状态下，而不会在冷却期间降低超低温保存液的黏度，引发脱水速率的增加(避免细胞内冰晶形成以及冷却损伤)，动力学抑制冰晶形成。迄今为止，HES已成功用于冷冻保存许多生物材料，包括胰岛、肉芽细胞、仓鼠细胞和其他一些细胞类型[34]。非渗透性CPA具有低毒性的特点，但单独使用保护效果欠佳，联合使用渗透性和非渗透性CPA可以减轻毒性，同时实现更强的血管内皮细胞保护作用。Sultani等[35]通过将DMSO与HES联用改善了超低温保存后人脐静脉内皮细胞的活力。

2.3新型CPA——间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC) 除多种CPA联合应用外，MSC在组织再生中发挥重要作用并被广泛研究[36]，如伤口修复、维持组织稳态和促血管化。在适当的条件下，MSC可以被激活，获得内皮表型，分化为周细胞或内皮细胞，并掺入血管壁中，该血管壁支持新血管形成和稳定原有血管。此外，MSC能够分泌各种血管生成因子，例如血管内皮生长因子、血管生成素、成纤维细胞生长因子和白细胞介素-6，诱导血管内皮细胞募集以建立血管形成的微环境[37]，这些因素均有利于血管生成。Xia等[38]在小鼠卵巢超低温保存中加入MSC发现，其可以促进卵巢血管的生成。MSC可作为新型CPA与渗透性和非渗透性CPA一起发挥保护作用，这一研究为探索CPA的种类提供了新思路。

3 小 结

玻璃化保存是血管超低温保存的首选技术，为使超低温保存液达到玻璃化状态需要添加高浓度的CPA。常见CPA中的DMSO具有较大的毒性作用，故低毒性的CPA(如多糖类)及无毒性的CPA为研究热点。针对不同的部位及种类血管组织，如何选择合适的CPA并靶向制订超低温保存方案，既确保血管超低温保存后具有生物活性，降低免疫原性，又能抑制血栓形成，有待进一步研究。期待在未来，通过技术的革新，对血管及其他器官制订出一套完整的靶向超低温保存方案，并成立“血管银行”甚至“器官银行”，为临床应用及科研发展提供更多的便利。