氯化钙处理对鲜切火龙果品质及γ-氨基丁酸积累的影响

李甜荣,汤静,祝竞芳,游万里,金鹏,郑永华

(南京农业大学食品科学技术学院,江苏 南京 210095)

火龙果(Hylocereusundatus)色彩夺目,外形奇特,果肉中富含黄酮类物质、维生素及水溶性膳食纤维,营养保健价值极高[1]。鲜切果蔬是近年兴起的新型消费形式,发展迅速,应用前景广阔[2]。火龙果因个大且要去皮,食用不便,特别适用于切分后食用,但切割造成的机械损伤会导致火龙果质地软化、汁液流失、组织褐变、微生物侵染等,严重影响其商品价值。Ca2+作为植物体内的第二信使,参与调控植物生长发育进程和逆境胁迫信号转导[3],外源钙处理也因其绿色、有效而被广泛应用于果蔬保鲜,对鲜切生姜[4]、生菜[5]、芒果[6]等的研究表明,外源钙处理可延缓这些鲜切果蔬的后熟衰老,抑制组织褐变,减少抗坏血酸等营养物质的损失,从而延长货架期。但氯化钙处理对鲜切火龙果保鲜的作用尚未见报道。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种广泛存在于动植物及微生物中的四碳非蛋白质氨基酸,它具有促进睡眠、减轻压力、缓解焦虑、降血压、调节心律失常和激素分泌等多种生理功效[7]。不同植物中GABA含量各不相同,一般为2～700 nmol·g-1[8]。研究表明,植物在受到低温[9]、缺氧[10]和机械损伤[11]等逆境胁迫时会激发自身内源酶的活性,进而大量合成积累GABA,从而提高植物对这些逆境的抗性。鲜切处理造成的机械损伤虽然会给果蔬组织带来软化、褐变等一系列不良的生理生化反应,但同时也会诱导果蔬自身产生防御反应,生成多酚等次生代谢产物以修复损伤和抵抗微生物入侵[12]。近年来的研究表明,鲜切损伤还可诱导果蔬中GABA的富集,从而提高潜在的营养保健价值。例如鲜切处理通过激活GABA代谢关键酶的活性,促进了胡萝卜丝中GABA的积累[13-14]。另外,外源钙处理可以提高鲜切胡萝卜[15]和梨[16]中的GABA含量。我们前期的研究发现,鲜切处理可以诱导火龙果中酚类物质合成积累,提高其抗氧化性,且损伤强度越大,贮藏温度越高,合成积累越多,抗氧化活性越高[17-18]。但有关鲜切加工和外源钙处理对火龙果GABA的合成影响尚未见报道。因此,本试验先研究不同质量浓度外源CaCl2处理对鲜切火龙果贮藏期间的品质和GABA含量变化的影响,在此基础上从GABA支路及多胺降解途径探究钙调控GABA富集的可能机制,以期为鲜切火龙果的加工保鲜和科学食用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

以‘白玉龙’火龙果为试材,挑选大小均匀、成熟度一致[可溶性固形物(TSS)含量13.3%左右]、无病虫害的果实用于试验。

仪器:GL-20G-H型冷冻离心机购于上海安亭科学仪器厂;UV-1600型紫外分光光度计购于上海美谱达仪器有限公司;DK-S26型电热恒温水浴锅购于上海森信实验仪器有限公司;LC-20A高效液相色谱仪购于日本岛津公司。

1.2 试验方法

1)不同质量浓度CaCl2处理:将挑选好的果实用200 μmol·L-1次氯酸钠溶液消毒2 min后,晾干表面水分,去皮后切割成1/4片状(1 cm厚,损伤强度为3.2 cm2·g-1),分别置于0(蒸馏水)、5、10、15和20 g·L-1CaCl2溶液浸泡处理10 min。处理后的火龙果片用20 cm×12 cm×8 cm塑料保鲜盒包装,每盒18片、约200 g,置于(10±1)℃、85%～90%相对湿度(RH)下贮藏,分别贮藏于12、24、48和72 h时取样测定。取样时每次随机选取3盒,一部分用于测定果肉颜色、可溶性固形物、菌落总数等指标,另一部分液氮速冻后冷冻保存,用于测定其他指标。其中10 g·L-1CaCl2处理能有效抑制鲜切火龙果微生物的生长并显著诱导GABA的合成。

2)10 g·L-1CaCl2及钙调蛋白拮抗剂三氟拉嗪(TFP)处理:将鲜切后的火龙果片分别用蒸馏水、10 g·L-1CaCl2和200 μmol·L-1TFP[19]溶液浸泡处理10 min,处理结束后分装于保鲜盒中,于(10±1)℃、85%～90% RH条件贮藏72 h,定期取样进行分析测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 果肉褐变指数(BI)测定采用Minolta CR200色差计随机选取若干点测定其L*、a*和b*值。褐变指数计算公式[20]如下:

1.3.2 可溶性固形物(TSS)、可滴定酸(TA)和抗坏血酸(AsA)含量的测定使用手持阿贝折射仪(ATAGO,日本)测量TSS含量,结果以百分数(%)表示。可滴定酸和抗坏血酸含量测定参照曹建康等[21]的方法,结果分别以苹果酸质量分数(%)和mg·100 g-1表示。

1.3.3 菌落总数测定菌落总数测定参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定:GB 4789.2—2016》,结果以lg(CFU·g-1)表示。

1.3.4 谷氨酸、GABA和钙调蛋白(CaM)含量测定谷氨酸含量测定参照Al-Quraan等[22]的方法,结果以mg·g-1表示。GABA含量测定参照Wang等[15]的方法,结果以mg·100 g-1表示。CaM含量采用酶联免疫试剂盒(南京丁贝生物科技有限公司)按操作要求测定。

1.3.5 谷氨酸脱羧酶(GAD)和GABA转氨酶(GABA-T)活性测定GAD活性测定参照Li等[23]的方法,将基于蛋白含量反应体系每小时生成1 μg GABA定义为一个酶活单位。GABA-T活性采用酶联免疫试剂盒(南京梅林学海生物科技有限公司)按操作要求测定。

1.3.6 多胺含量测定多胺含量测定参照林绍艳等[24]的方法,采用外标法进行测定,结果以μg·g-1表示。

1.3.7 二胺氧化酶(DAO)、多胺氧化酶(PAO)和4-氨基丁醛脱氢酶(AMADH)活性测定DAO、PAO活性测定参照Wang等[15]的方法,将555 nm波长下吸光值每变化0.001定义为一个酶活单位。AMADH活性测定参照Yin等[25]的方法,将340 nm波长下吸光值每变化0.001定义为一个酶活单位。

上述测定酶的活性均基于蛋白含量反应体系以U·mg-1表示,蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[21]。

1.4 数据处理

采用SAS 8.0软件进行数据统计分析,用Origin 2018进行绘图。采用邓肯氏多重比较法在0.05水平下进行差异显著性分析检验,即P<0.05表示差异显著。

图1 CaCl2处理对鲜切火龙果贮藏期间褐变指数(A)及可溶性固形物(TSS,B)、可滴定酸(C)和抗坏血酸(D)含量的影响Fig.1 Effect of CaCl2 treatment on browning index(A),and total soluble solids(TSS,B),titratable acid(C) and ascorbic acid(D)contents of fresh-cut pitaya fruit during storage

2 结果与分析

2.1 CaCl2处理对鲜切火龙果品质的影响

由图1-A可知:随着贮藏时间延长,鲜切火龙果褐变指数(BI)不断上升,CaCl2处理可延缓BI的上升,减轻果实的褐变程度,使其维持较好的感官品质,其中10 g·L-1CaCl2处理组效果最为显著。如图1-B所示:贮藏期间,鲜切火龙果的TSS含量整体呈下降趋势,且随着钙处理浓度增加TSS含量下降减少,但15和20 g·L-1CaCl2处理组之间差异不明显。表明钙处理在一定程度上可以抑制鲜切火龙果的呼吸作用,减少糖分损失,较好地保持鲜切火龙果的滋味品质。由图1-C所示:鲜切火龙果贮藏期间可滴定酸(TA)含量不断下降,对照组在贮藏前期急剧下降,中后期变化平缓,至贮藏结束其TA含量与初始相比下降了29%,而CaCl2处理显著延缓了TA含量的下降,维持火龙果较好的品质。由图1-D可知:AsA含量在贮藏期间整体呈下降趋势,前12 h下降幅度较大。CaCl2处理延缓了鲜切火龙果AsA含量的下降,且随着钙处理浓度增加下降减少。至贮藏结束时,对照组火龙果中AsA含量与初始相比下降45.77%,而 20 g·L-1CaCl2处理组只下降19.59%,表明CaCl2处理可以减少鲜切火龙果AsA氧化的损失,从而使其保持较好的营养品质。

2.2 CaCl2处理对鲜切火龙果菌落总数和GABA含量的影响

如图2-A所示:贮藏期间鲜切火龙果菌落总数逐渐增加,但均未超过105CFU·g-1,不同质量浓度CaCl2处理均可抑制微生物的生长和菌落总数的增加,其中以10 g·L-1CaCl2处理组的效果最为显著。如图2-B所示:贮藏前期鲜切火龙果GABA含量迅速上升,于24 h达到峰值后开始下降。CaCl2处理均促进鲜切火龙果中GABA的合成积累,其中10 g·L-1CaCl2处理效果最显著,在贮藏24 h时GABA含量比初始值增加54.6%。

上述结果表明,10 g·L-1CaCl2处理显著抑制鲜切火龙果微生物的生长,延缓其品质下降,提高鲜切火龙果中GABA的含量,从而改善其营养和安全品质。

图2 CaCl2处理对鲜切火龙果贮藏期间菌落总数(A)和GABA含量(B)的影响Fig.2 Effect of CaCl2 treatment on total plate count(A)and GABA content(B)of fresh-cut pitaya fruit during storage

2.3 钙和TFP处理对鲜切火龙果贮藏期间谷氨酸和GABA含量的影响

由图3可知:鲜切火龙果谷氨酸含量在贮藏前期显著下降,在24 h降到最小值后趋于平缓甚至缓慢上升;GABA含量在前24 h呈上升趋势,达到最大值后开始下降。10 g·L-1CaCl2处理显著促进鲜切火龙果中GABA的合成积累,最高可达30.33 mg·100 g-1,且其谷氨酸含量低于对照组,表明可能有更多谷氨酸转化生成GABA,而TFP处理则抑制了这一反应,生成较少的GABA。

图3 钙和三氟拉嗪(TFP)处理对鲜切火龙果贮藏期间谷氨酸(A)和GABA含量(B)的影响Fig.3 Effects of calcium and trifluoperazine(TFP)treatments on glutamate(A)and GABA contents(B) of fresh-cut pitaya fruit during storage 不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same as follows.

2.4 钙和TFP处理对鲜切火龙果贮藏期间CaM含量和GAD、GABA-T活性的影响

由图4-A可知:CaCl2处理提高了火龙果中CaM含量,于24 h达到峰值后开始下降,可能促进更多的Ca2+-CaM复合体形成,而TFP处理显著降低了CaM含量,阻碍Ca2+-CaM复合体的形成。贮藏期间,各处理组GAD和GABA-T的活性均呈先上升后下降的趋势,CaCl2处理提高了GAD和GABA-T的活性,而TFP处理显著降低了GAD活性,同时对GABA-T活性也有抑制(图4-B、C)。表明10 g·L-1CaCl2处理可以激活鲜切火龙果中GABA代谢,提高CaM含量并诱导提升GAD活性,使更多的谷氨酸转化成为GABA,进而提高GABA含量,而TFP处理则降低了CaM含量并抑制GAD活性。

图4 钙和TFP处理对鲜切火龙果贮藏期间CaM含量(A)和谷氨酸脱羧酶(GAD,B)、GABA转氨酶 (GABA-T,C)活性的影响Fig.4 Effects of calcium and TFP treatments on CaM content(A)and glutamate decarboxylase(GAD,B), γ-aminobutyric acid transaminase(GABA-T,C)activities of fresh-cut pitaya fruit during storage

图5 钙和TFP处理对鲜切火龙果贮藏期间腐胺、精胺、亚精胺含量及二胺氧化酶(DAO)、 多胺氧化酶(PAO)、4-氨基丁醛脱氢酶(AMADH)活性的影响Fig.5 Effects of calcium and TFP treatments on the contents of Put,Spm,Spd and activities of diamine oxidase(DAO),polyamine oxidase(PAO),4-aminobutyraldehyde dehydrogenase(AMADH) of fresh-cut pitaya fruit during storage

2.5 钙和TFP处理对鲜切火龙果贮藏期间多胺降解途径的影响

如图5所示:贮藏前期对照组和CaCl2处理组火龙果的腐胺、精胺、亚精胺含量下降,中后期缓慢上升,且CaCl2处理组含量低于对照组;TFP处理组腐胺和精胺含量在前期先上升后下降,且含量显著高于另外2个处理组,亚精胺含量呈先下降再上升后下降的趋势。各处理组中DAO、PAO、AMADH活性变化趋势一致,均先上升后下降,CaCl2处理提高了贮藏期间鲜切火龙果中DAO、PAO、AMADH活性,而TFP虽然是CaM抑制剂,但其也降低了DAO、PAO、AMADH活性,减少多胺降解转化。表明10 g·L-1CaCl2处理可以激活多胺降解途径,提高胺氧化酶活性,促使多胺底物降解转化生成GABA,进而提高GABA含量。

3 讨论

火龙果经过鲜切处理后细胞破碎,与空气接触的比表面积增加,易引起果肉褐变、组织软化、汁液外流,并促进微生物生长繁殖,大大缩短货架期,因此抑制果肉褐变、组织软化及微生物生长是鲜切火龙果保鲜的关键。Ca2+可作为植物细胞膜的保护剂,通过与磷脂、蛋白质羟基和磷酸盐桥接进而增强膜稳定性,且其可与细胞壁多糖交联构成离子键,维持细胞壁结构[26]。采用CaCl2处理可延缓鲜切果蔬组织褐变、减少营养物质损失,从而延长货架期,如CaCl2处理可延迟鲜切马铃薯[27]、苹果[28]中PPO活性高峰的到来,延缓褐变进程;抑制鲜切萝卜[29]、芹菜[30]中TA、AsA含量的下降,减少还原糖和总糖消耗,从而延缓鲜切果蔬的衰老。本试验中,不同质量浓度的CaCl2处理可以延缓鲜切火龙果中TSS、TA和AsA含量的下降,抑制微生物生长,减轻果肉褐变,降低有机物的消耗,并促进GABA的合成,维持较好的贮藏品质的同时提高其营养特性。因此CaCl2处理在鲜切火龙果保鲜中具有较好的应用价值。

Ca2+作为高等植物中普遍存在的一种信号转导分子,逆境胁迫下与CaM结合形成Ca2+-CaM复合体调控下游靶蛋白的活性,进而介导调控由Ca2+引起的一系列胁迫反应,提高植物抗逆性[31-32],GABA合成积累也是植物抗逆反应的表现。高等植物中GABA有2条合成转化途径,即GABA支路和多胺降解途径,前者是主要合成途径,谷氨酸在GAD作用下发生脱羧反应生成GABA,而后经过GABA-T催化生成琥珀酸半醛,最终经琥珀酸半醛脱氢酶催化生成琥珀酸进入三羧酸循环[7]。GAD作为GABA支路中的限速酶,是一种钙调素结合蛋白,活性受Ca2+-CaM复合体的调控[33],TFP是CaM拮抗剂,可以影响Ca2+-CaM复合体的功能,阻碍植物间的信号转导[19]。植物中的多胺以游离状态或与酚酸、核酸和蛋白质结合存在[34],其可以在胺氧化酶和AMADH的催化作用下降解生成GABA。已有研究表明,外源CaCl2处理可以调控果蔬中GABA的合成,例如可以提高苹果[35]和梨[36]果实中GAD的相对表达水平及酶活性,从而显著促进GABA的合成,有效激活GABA支路代谢。另有研究发现CaCl2处理可同时激活胡萝卜丝[15]和鲜切梨[16]中的GABA支路及多胺降解途径,显著上调GAD、DAO、PAO和AMADH等酶基因相对表达水平并提高其活性,促进谷氨酸和多胺的降解转化,GABA含量明显增加。在本试验中,贮藏前期谷氨酸含量急剧下降,表明可能有更多的谷氨酸参与反应转化生成GABA,后期变化平缓甚至上升可能是因为生成的GABA被降解进入TCA循环后转化生成α-酮戊二酸,进而促进谷氨酸的合成。Wu等[37]研究认为茶叶中腐胺是多胺降解途径中GABA合成的主要底物。本试验中贮藏前期对照组和CaCl2处理组腐胺含量急剧下降,表明其可能更多参与降解途径,分解大于合成,从而生成更多的GABA。此外,10 g·L-1CaCl2处理提高了鲜切火龙果贮藏期间CaM含量和GAD、DAO、PAO、AMADH活性,催化更多谷氨酸和多胺转化,进而提高GABA含量,这与贮藏前期火龙果中谷氨酸、多胺含量的降低相互印证,而TFP处理CaM含量较低,GAD和胺氧化酶的活性也被抑制,底物转化减少,合成较少的GABA。这些结果表明,10 g·L-1CaCl2处理可同时激活鲜切火龙果中的GABA支路和多胺降解途径,其可能通过促进Ca2+-CaM复合体的形成进而提高GAD和胺氧化酶的活性从而促进GABA的合成积累,而TFP处理则可能阻碍了Ca2+-CaM复合体的形成,使其功能发生障碍,降低了GAD和胺氧化酶的活性,从而减少GABA的生物合成。因此外源钙处理可能通过调控鲜切火龙果中Ca2+-CaM复合体的形成进而促进GABA的合成积累,但关于外源钙处理促进GABA积累的分子机制尚不清楚,有待于进一步研究。

本试验研究表明,10 g·L-1CaCl2处理可有效减少10 ℃贮藏条件下鲜切火龙果TSS、TA消耗、AsA氧化,减轻果肉褐变,抑制微生物生长,维持较好的品质,从而延长货架期。此外,10 g·L-1CaCl2处理还显著促进鲜切火龙果中GABA的合成,提高CaM含量及GAD和胺氧化酶的活性,催化谷氨酸和多胺降解转化,促进GABA的合成积累,而TFP处理降低了CaM含量,抑制了GAD及胺氧化酶的活性和GABA的积累,表明钙处理可能是通过调控Ca2+-CaM复合体的形成进而促进GABA的合成积累。